CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu định lượng atenolol và đồng phân đối quang trong chế phẩm
a. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC, phân tích trực tiếp các ĐPĐQ của ATN trong một số chế phẩm thuốc viên nén với các cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang có thành phần và bản chất khác nhau như cột Ultron ES – OVM (pha đảo), Chiralcel AGP (pha đảo), Chirex 3022 (pha thuận), Astec cyclobond I (pha đảo hoặc pha thuận tùy tính chất phân cực của hệ pha động), Chiralpak CBH (pha đảo).
Đối với mỗi loại cột, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau như: thành phần, tỷ lệ các thành phần trong pha động; ảnh hưởng pH của dung dịch đệm; tốc độ dòng; thể tích tiêm mẫu; nồng độ chất phân tích... Các điều kiện sắc ký ban đầu đối với mỗi cột được lựa chọn theo khuyến nghị của hãng sản xuất. Quy trình khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động đối với mỗi cột sắc ký được trình bày ở các hình sau:
Hình 2.2. Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Ultron ES-OVM
Hình 2.3. Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Chirex 3022
Không tách, RS
thấp, tR ngắn
Có tách, tR dài Không tách, tR dài
Tăng pH từng bước và giảm tỉ lệ 2-propanol
Thay đổi pH xuống 4 và/hoặc tăng tỉ lệ 2 -
propanol
Thay 2–propanol bằng dung môi khác:
CH3CN, CH3OH, C2H5OH, 1-propanol Có tách, tR không
quá dài
Tối ưu hóa pH và tỉ lệ thành phần
Không tách
2-propanol/dung dịch đệm NaH2PO410 mM pH 4,5 tỷlệ 5/95
CH3CN/dung dịch đệm : 35/65
Có rửa giải
CH3CN/dung dịch đệm : 75/25
1.Thay đổi pH 2.Thay đổi dung môi hữu cơ
1.Điều chỉnh tỉ lệ dung môi hữu cơ 2.Thay đổi đệm.
Hoặc:
1. Điều chỉnh pH
2. Thay đổi dung môi hữu cơ
Không tách Có tách
Không rửa giải
Có tách
Không tách
Không rửa giải Có rửa giải
Không tách Có tách
1.Tối ưu tỉ lệ HOAc/TEA.
2.Tăng nồng độ HOAc/TEA
1. Giảm CH3OH xuống 1%
2. Thay đổi tỉ lệ và giảm nồng độ HOAc/TEA
1. Tăng CH3OH lên 10%
2. Tăng nồng độ HOAc/TEA
Có rửa giải Không tách
Có tách
Chuyển sang sắc ký dùng hệ dung môi hữu cơ phân cực
CH3CN/CH3OH/HOAc/TEA:
95/5/0,3/0,2 Không tách
Hình 2.4. Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Chiracel AGP
Hình 2.5. Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Astec Cyclobond I 2000
(Chú giải: HOAc – acid acetic; TEA – triethylamin)
Không tách, RS
thấp, tR ngắn
Giảm pH từng bước tới 5,0 và thay đổi tỉ lệ 2-propanol
trong khoảng 0-15%
Có tách, tR không quá dài
Tối ưu hóa pH và tỉ lệ thành phần
2-propanol /dung dịch đệm amoni acetat 10 mM pH 7,0 tỷ lệ 5/95
Hình 2.6. Quy trình khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động trên cột Chiralpak CBH Từ các kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng đồng thời ĐPĐQ của ATN trong các mẫu chế phẩm thuốc.
b. Phương pháp điện di mao quản
Nghiên cứu phân tách các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc bằng phương pháp điện di mao quản vùng với các điều kiện ban đầu như sau: cột mao quản silica nung chảy, có chiều dài hiệu dụng khoảng 50-70 cm, đường kính trong 50 μm, nhiệt độ mao quản 25 oC, điện thế hai đầu mao quản 20 kV, chế độ tiêm mẫu 50 mbar x 3 giây, bộ phận phát hiện là đầu dò mảng diod. Cột mao quản mới được rửa với MeOH trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid HCl 0,1M trong 15 phút và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút. Trong ngày phân tích cột mao quản được xử lý như sau:
+ Đầu các ngày phân tích, mao quản được rửa bằng dung dịch NaOH 0,1M 15 phút, nước 5 phút và với dung dịch điện ly nền (BGE) 15 phút.
+ Giữa các lần điện di, cân bằng cột với nước trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1M trong 2 phút, nước 2 phút và dung dịch BGE 2 phút.
+ Cuối ngày phân tích, cột mao quản được rửa với dung dịch NaOH 0,1M trong 20 phút, nước 20 phút, sau đó thổi khí nitrogen 3 phút.
Để tách đồng phân ATN trong hỗn hợp racemic, một số tác nhân đối quang dẫn chất cyclodextrin như β-CD (CD tự nhiên), HP-β-CD (dẫn chất hydroxyalkyl β-CD không mang điện) và CM-β-CD (dẫn chất carboxymethyl β-CD mang điện tích) được sử dụng để thêm vào dung dịch điện ly nền. Trong quá trình thực nghiệm, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như dung dịch điện ly nền (thành phần, pH, nồng độ dung dịch đệm); bản chất và nồng độ tác nhân đối quang; hiệu điện thế hai đầu mao quản; nồng độ dược chất… đến khả năng tách đồng phân ATN để lựa chọn điều kiện điện di phù hợp.
Phương pháp CZE phù hợp khi: hai pic đồng phân tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5 và phân tách khỏi các thành phần tá dược có trong mẫu; hệ số đối
xứng của hai pic đồng phân nằm trong khoảng 0,8 - 1,5; đáp ứng đầu dò cao; đường nền ít bị nhiễu và có độ đúng, độ chính xác đáp ứng yêu cầu.
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng atenolol và đồng phân trong chế phẩm Thẩm định các phương pháp HPLC, CE phân tích ĐPĐQ của ATN trong một số chế phẩm thuốc theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của ICH và quy định của Dược điển Việt Nam, Dược điển Mỹ, Dược điển châu Âu… [4], [67], [69], [94], [185]. Tiến hành thẩm định phương pháp trên các mẫu giả dược (placebo); mẫu chuẩn (mẫu chứa các chất chuẩn ATN racemic; R-ATN hoặc S-ATN có hàm lượng/nồng độ xác định) và các mẫu thử (chế phẩm thuốc chứa ATN dạng racemic và/hoặc chế phẩm thuốc chỉ chứa S-ATN). Quy trình chuẩn bị các mẫu dùng trong quá trình thẩm định được xây dựng cho từng phương pháp.
Các tiêu chí thẩm định phương pháp bao gồm [4], [67], [69], [94], [185]:
a. Độ phù hợp của hệ thống: Tiến hành phân tích (sắc ký hoặc điện di) lặp lại 6 lần các dung dịch chuẩn S-ATN, R-ATN và R,S-ATN với nồng độ phù hợp. Xác định độ phân giải (Rs) giữa các pic đồng phân và các thông số đặc trưng cho mỗi pic của mỗi phương pháp. Giá trị RSD của tR (phương pháp HPLC) hoặc tm (phương pháp CE) và diện tích pic giữa các lần phân tích phải 2,0% (phương pháp CE cho phép 3,0%), Rs giữa các pic đồng phân phải 1,5 và các pic phải có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5.
b. Tính chọn lọc–đặc hiệu của phương pháp: Tiến hành phân tích các mẫu trắng, mẫu giả dược (placebo) và các mẫu chuẩn ATN theo các phương pháp đã xây dựng. Trên sắc ký đồ (SKĐ) hoặc điện di đồ (ĐDĐ), pic của các đồng phân phải tách nhau hoàn toàn (Rs > 2,0) và tách khỏi pic chất tạp (nếu có). Trên SKĐ hoặc ĐDĐ mẫu giả dược, mẫu thử tại thời điểm tương ứng với các pic R-ATN và S-ATN (trên SKĐ hoặc ĐDĐ mẫu chuẩn) phải không xuất hiện pic. Trên SKĐ mẫu chuẩn và mẫu thử, pic R-ATN và S-ATN phải có tR, hình dạng pic và phổ UV tương tự nhau. Thời gian di chuyển (tm) và hình dáng pic trên ĐDĐ mẫu thử và mẫu chuẩn phải như nhau.
c. Khoảng nồng độ tuyến tính: Phân tích các mẫu chuẩn ATN có nồng độ phù hợp.
Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ATN trong mẫu bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Hệ số tương quan r giữa diện tích pic và nồng độ ATN xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính phải xấp xỉ 1 (r 0,99).
d. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Tiến hành phân tích các mẫu giả dược và các mẫu giả dược có thêm chất chuẩn chất cần phân tích với các nồng
độ xác định. Xác định giá trị LOD của phương pháp theo công thức:
a x 3 ,
LOD 3 (khối lượng/thể tích)
với là độ lệch chuẩn đáp ứng của các mẫu giả dược; a là hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và tín hiệu đo của chất cần phân tích.
Trường hợp không xác định được đáp ứng của mẫu giả dược, tiến hành xác định giá trị LOD theo phương pháp nhiễu đường nền hoặc bằng phương pháp thực nghiệm pha loãng dần đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được trên thiết bị. Giá trị LOQ của phương pháp được xác định bằng 3,3 lần giá trị LOD.
e. Độ đúng: Tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn vào các mẫu giả dược. Thêm chính xác một lượng chất chuẩn ATN racemic vào các mẫu giả dược tương ứng với 3 mức: 80, 100 và 120% mức nồng độ định lượng theo quy trình. Mỗi mức nồng độ tiến hành phân tích 3 mẫu độc lập. Xác định độ đúng theo công thức:
Độ đúng = Lượng ATN xác định được theo quy trình
× 100%
Lượng ATN chuẩn thêm vào
Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải đạt 98,0% - 102,0%.
f. Độ chụm: Phân tích xác định nồng độ ATN trong các mẫu thử theo quy trình đã xây dựng. Xác định độ chụm trong ngày (độ lặp lại) dựa trên giá trị RSD của các kết quả xác định nồng độ ATN trong các mẫu thử trong cùng một ngày, một điều kiện phân tích. Xác định độ chụm khác ngày (độ tái lại) dựa trên giá trị RSD kết quả xác định nồng độ ATN trong các mẫu thử giữa các ngày phân tích. Yêu cầu giá trị RSD 2,0%.
2.3.1.3. Phân tích atenolol và đồng phân đối quang trong một số mẫu thuốc
Tiến hành phân tích xác định nồng độ ATN toàn phần và các ĐPĐQ của ATN (S-ATN và R-ATN) trong một số chế phẩm thuốc lưu hành trên thị trường bằng các phương pháp HPLC và CE đã được nghiên cứu xây dựng và thẩm định ở trên. Đánh giá chất lượng các thuốc dựa trên kết quả so sánh hàm lượng hoạt chất trong mẫu so với hàm lượng hoạt chất ghi nhãn và so sánh hàm lượng hoạt chất giữa các sản phẩm bằng thống kê t-test. So sánh kết quả định lượng của hai phương pháp bằng thống kê t-test và F-test. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất R-ATN trong các chế phẩm S-ATN và đánh giá chất lượng các thuốc.
Xác định hàm lượng ATN hòa tan trong các môi trường thử độ hoà tan bằng phương pháp HPLC. So sánh biểu đồ hòa tan, đánh giá tương đương hòa tan in vitro của các thuốc theo hướng dẫn so sánh độ hòa tan của WHO và US-FDA [183], [199].