Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG CHẾ PHẨM

3.1.2. Nghiên cứu định lượng các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm bằng HPLC

3.1.2.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn R,S-ATN trong MeOH nồng độ khoảng 50 àg/ml trên các cột HPLC với các điều kiện sắc ký khác nhau như nội dung trình bày ở Mục 2.3.1.1.a.

Kết quả khảo sát phân tách các ĐPĐQ của ATN với 5 cột sắc ký chứa pha tĩnh hoạt quang như sau:

a. Phân tích trên cột Ultron ES – OVM

Khi pha động chỉ chứa thành phần đệm, không có các dung môi có lực rửa giải mạnh như MeOH, MeCN thì ATN cũng vẫn được rửa giải khỏi cột với thời gian lưu tương đối ngắn (Hình 3.7a).

Với pha động có thành phần là đệm pH 7,0–MeOH tỷ lệ 99:1, tốc độ dòng 0,75 ml/phút thì dung dịch chuẩn R,S-ATN vẫn chỉ có 01 pic duy nhất trên SKĐ, các ĐPĐQ của ATN chưa phân tách khỏi nhau (Hình 3.7b).

Hình 3.7. SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Ultron ES – OVM ở bước sóng

 = 230 nm và các pha động: đệm phosphat 20mM, pH 3,0; 0,75 ml/phút (a);

đệm phosphat 20mM, pH 7,0 – MeOH (99:1); 0,75 ml/phút (b).

b. Phân tích trên cột Chiral AGP

Khi thay isopropanol (2-PrOH) bằng MeOH, đồng thời giảm tỷ lệ dung môi hữu cơ phân cực trong pha động và tăng pH của dung dịch đệm từ 4,5 lên tới 7,0 thì khả năng phân tách các đồng phân R-ATN và S-ATN của cột tăng lên.

Tuy vậy, với pha động bao gồm MeOH – đệm phosphat 20mM, pH 7,0 tỷ lệ 0,5 : 99,5 (v/v); tốc độ dòng 0,75 ml/phút trên SKĐ các pic ĐPĐQ của ATN vẫn chưa tách nhau (Hình 3.8).

(a) (b)

Hình 3.8. SKĐ phân tích R,S-ATN trên cột Chiral AGP với tốc độ dòng 0,75 ml/phút;

đầu dò DAD ( = 230 nm) và các pha động (a): 2-PrOH - đệm NaH2PO4 10mM, pH 4,5 (1:99); (b): MeOH - đệm NaH2PO4 10mM, pH 7,0 (0,5:99,5) c. Phân tích trên cột Astec Cyclobond I

Triển khai sắc ký kiểu pha đảo với pha động chứa MeCN – đệm amoni acetat pH 4,0 với tỷ lệ 35 : 65 (v/v), ATN chưa được rửa giải qua cột. Tăng tỷ lệ MeCN trong pha động, ATN được rửa giải khỏi cột, tuy nhiên các đồng phân không tách (Hình 3.9a).

Khi triển khai sắc ký với hệ pha động chứa các thành phần dung môi hữu cơ phân cực (MeCN–MeOH–acid acetic–triethylamin), ATN đã được rửa giải song các đồng phân R- và S-ATN không tách, ngay cả khi tỷ lệ MeOH trong pha động giảm xuống dưới 1% và acid acetic, triethylamin trong pha động chỉ có nồng độ 0,1% (Hình 3.9b).

Hình 3.9. SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Astec Cyclobond I cùng các pha động (a): đệm amoni acetat, pH 4–MeCN (25:75) và (b): MeCN–MeOH–acid acetic–

triethylamin (99:1:0,1:0,1) với tốc độ 1,0 ml/phút và đầu dò DAD ( = 230 nm)

(a) (b)

(a) (b)

d. Phân tích trên cột Chirex 3022

Khảo sát với hệ pha động ban đầu n-hexan–1,2 dichloromethan–MeOH–TFA (50:35:7,5:0,25) tốc độ dòng 1,0 ml/phút, các đồng phân R-, S-ATN trong mẫu hỗn hợp chuẩn đã bước đầu phân tách song chưa hòa toàn (Hình 3.10a). Khi giảm tỷ lệ dung môi không phân cực (n-hexan, dichloromethan) trong thành phần pha động, pic ATN xuất hiện sớm, hệ số phân giải Rs giữa các pic đồng phân giảm. Ngược lại khi tăng tỉ lệ dung môi không phân cực thì tR và hệ số Rs giữa các pic đồng phân tăng.

Khi cố định tỷ lệ thành phần dung môi không phân cực và tăng tỷ lệ MeOH trong pha động thì pic ATN sẽ xuất hiện sớm hơn, hệ số Rs giữa các pic R- và S-ATN giảm đi và ngược lại (Hình 3.10b). Tỷ lệ acid TFA trong pha động ít ảnh hưởng tới tR của các pic R- và S-ATN song có ảnh hưởng đến độ phân giải và hình dạng pic.

Hình 3.10. SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích bằng cột Chirex 3022, DAD ( = 230 nm), pha động n-hexan–CH2Cl2–MeOH–TFA với các tỷ lệ 50:35:7,5:0,25 (a);

50:35:10:0,25 (b); 57,5:35:7,5:0,25 (c) và 50:35:5:0,25 (d)

Hệ pha động n-hexan–CH2Cl2–MeOH–TFA tỷ lệ 50:35:5:0,25 (Hình 3.10d) các pic R- và S-ATN tách nhau với Rs  3 nhưng thời gian phân tích kéo dài (hơn 30 phút), các pic có xu hướng bị doãng, chiều cao và diện tích pic giảm. Với hệ pha động n-hexan–

(a) (b)

(c) (d)

CH2Cl2–MeOH–TFA tỷ lệ 57,5:35:7,5:0,25 (Hình 3.10c) trên SKĐ các pic R- và S- ATN có hình dạng cân đối (T < 2,0); hệ số Rs > 1,5; tR dưới 20 phút, tín hiệu đo lớn, thích hợp để phân tách các ĐPĐQ của ATN.

e. Phân tích trên cột Chiralpak CBH

Với hệ pha động ban đầu chứa 2-PrOH : đệm amoni acetat 10 mM, pH 7,0 tỷ lệ 5/95 (v/v) các pic của S- và R-ATN đã tách nhau, tuy nhiên độ phân giải còn thấp (Rs < 2).

Khi cố định tốc độ dòng pha động 0,7 ml/phút, pH dung dịch đệm là 7,0 và thay đổi tỷ lệ 2-PrOH trong pha động từ 1% đến 15% thì khả năng phân tách giữa các đồng phân tăng lên. Tỷ lệ 2-PrOH càng cao, độ phân giải giữa các pic càng lớn và thời gian phân tích càng kéo dài, tín hiệu đo càng nhỏ (Hình 3.11).

Hình 3.11. SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Chiralpak CBH, pha động 2-PrOH/đệm amoni acetat 10 mM, pH 7,0 với các tỷ lệ 1/99(a) và 15/85(b) Cố định tốc độ dòng và tỷ lệ 2–PrOH : đệm amoni acetat 10 mM trong pha động nhưng thay đổi pH của dung dịch đệm trong khoảng 5,0 – 7,0 kết quả phân tích cho thấy khi pH của dung dịch đệm tăng, độ phân giải giữa các pic R-, S-ATN tăng lên;

thời gian phân tích kéo dài; diện tích và chiều cao pic giảm đi (Hình 3.12).

Hình 3.12. SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Chiralpak CBH với các pha động có pH dung dịch đệm 5,0 (a) và 7,0 (b)

(a) (b)

(a) (b)

f. Kết quả nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC phân tích ĐPĐQ của ATN

Kết quả nghiên cứu khảo sát cho thấy, cả hai phương pháp HPLC sử dụng các cột pha tĩnh đối quang Chirex 3022 và Chiralpak CBH đều có khả năng phân tách các ĐPĐQ của ATN.

Phương pháp HPLC với đầu dò DAD ở bước sóng 230 nm phân tích ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc với các cột Chirex 3022 và Chiralpak CBH cụ thể như sau:

 Phương pháp 1:

- Cột Chirex 3022 (4,0 x 250 mm; 5 àm) ổn định ở 25 C, cú bảo vệ cột.

- Pha động: n-hexan – 1,2 dichloromethan – methanol – acid trifluoroacetic, tỷ lệ 57,5 : 35 : 7,5 : 0,2 (v/v/v/v). Tốc độ dòng 1 ml/phút.

- Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl.

 Phương pháp 2:

- Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; 5àm), ổn định ở 25C, cú bảo vệ cột.

- Pha động: 2-propanol – dung dịch đệm amoni acetat 10 mM, pH 5,9 tỷ lệ 10 : 90 (v/v). Tốc độ dòng 0,7 ml/phút.

- Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl.

Sắc ký đồ phân tích mẫu chuẩn R,S-ATN bằng các phương pháp nêu trên được trình bày ở các Hình 3.13 và Hình 3.14.

Hình 3.13. SKĐ và phổ UV mẫu chuẩn R,S-ATN phân tích trên cột Chirex 3022 với pha động n-hexan –1,2 CH2Cl2–MeOH–TFA (57,5 : 35 : 7,5 : 0,2); 1,0 ml/phút.

Hình 3.14. SKĐ và phổ 3D phân tích mẫu chuẩn R,S-ATN với cột Chiralpak CBH; pha động 2-PrOH/dung dịch đệm amoni acetat 10 mM, pH 5,9 (10/90); 0,7 ml/phút.

Phương pháp phân tích trên cột sắc ký Chirex 3022 chứa tác nhân hoạt quang kiểu Pirkle có kiểu sắc ký pha thuận, thành phần dung môi hữu cơ không phân cực chiếm tỷ lệ chính trong pha động vì vậy có thể ghép nối với đầu dò MS để có được phương pháp LC-MS/MS phân tích các đồng phân đối quang ATN. Phương pháp phân tích trên cột Chiralpak CBH chứa tác nhân chọn lọc hoạt quang là một protein tự nhiên, có kiểu sắc ký pha đảo, hệ dung môi pha động có thành phần dung dịch đệm chiếm tỷ lệ lớn. Tuy nhiên, amoni acetat là một muối hữu cơ, dễ hóa hơi và phân hủy ở nhiệt độ cao, do vậy phương pháp này cũng có thể ghép nối được với đầu dò MS.

Cả hai phương pháp HPLC đều đã được thẩm định theo các hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích và đã được công bố trong các công trình liên quan đến luận án.

Tuy nhiên, phương pháp phân tích trên cột Chiralpak CBH có độ phân giải giữa các pic ĐPĐQ của ATN lớn hơn (Rs > 5,0); thời gian phân tích ngắn hơn (dưới 10 phút).

Do vậy, trong luận án chỉ trình bày kết quả thẩm định phương pháp phân tích các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc bằng HPLC với cột Chiralpak CBH.