CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG CHẾ PHẨM
3.1.2. Nghiên cứu định lượng các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm bằng HPLC
3.1.2.2. Thẩm định phương pháp HPLC phân tích đồng phân đối quang atenolol
Do khối lượng các chất chuẩn R-ATN và S-ATN cần dùng trong thẩm định phương pháp phân tích nhiều mà việc cung cấp các chất chuẩn này tương đối khó khăn với giá thành cao nên chúng tôi đã tiến hành xác định hàm lượng R-ATN và S-ATN có trong
mẫu chất chuẩn R,S-ATN (ATN racemic - chuẩn Dược điển Việt Nam) để sử dụng trong quá trình thẩm định phương pháp.
Các mẫu dùng để xác định hàm lượng ĐPĐQ của ATN trong mẫu chuẩn racemic được chuẩn bị như sau:
- Hòa tan các chuẩn S-ATN và R-ATN bằng MeOH trong các bình định mức 20 ml để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 0,025 mg/ml.
- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 50 mg mẫu chuẩn ATN racemic hòa tan trong vừa đủ 100 ml MeOH. Pha loãng các dung dịch trên 10 lần với MeOH để thu các dung dịch mẫu thử. Tiến hành chuẩn bị 3 mẫu thử song song.
Tiến hành sắc ký các mẫu theo phương pháp HPLC nêu ở trên.
Kết quả xác định hàm lượng R- và S-ATN trong mẫu chuẩn racemic được trình bày ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hàm lượng R-ATN và S-ATN trong chất chuẩn racemic
R-Atenolol S-Atenolol R,S-Atenolol
KL cân (mg)
Diện tích pic (mAU.s)
KL cân (mg)
Diện tích pic (mAU.s)
KL cân (mg)
Diện tích pic (mAU.s)
Hàm lượng (àg/mg) R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN
4,96
283589
4,97
284429 50,3 290755 290261 504,6 502,0 284859 283309 51,1 295053 293448 504,0 499,6 283507 283727 50,9 292821 292598 502,2 500,1
Trung bỡnh (àg/mg) 503,6 500,6
RSD (%) 0,2 0,3
Như vậy, chuẩn ATN (dạng racemic) số kiểm soát: 0102093, (thông tin ghi nhãn:
hàm lượng 100,17%, độ ẩm 0,11%) có hàm lượng S-ATN và R-ATN tương ứng là 500,6 và 503,6 àg/mg (tớnh theo nguyờn trạng). Hàm lượng cỏc ĐPĐQ trong mẫu chuẩn R,S-ATN được sử dụng để tính toán kết quả trong các nội dung tiếp theo của nghiên cứu.
b. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn R, S-ATN nồng độ chính xác khoảng 0,05 mg/ml theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn ở trên. Ghi lại các SKĐ, xác định các thông số đặc trưng của mỗi pic (thời gian lưu, diện tích, chiều cao) và độ phân giải giữa các pic R-ATN và S-ATN.
Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống sắc ký được trình bày trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
Stt
R-Atenolol S-Atenolol Độ
phân giải (Rs) tR
(phút)
Diện tích (mAU.s)
Chiều cao (mAU)
Hệ số Tailing
tR (phút)
Diện tích (mAU.s)
Chiều cao (mAU)
Hệ số Tailing
1 3,764 288690 28828 1,34 5,514 289792 19575 1,29 5,3 2 3,773 288680 28825 1,35 5,526 289518 19555 1,29 5,3 3 3,772 288858 28850 1,35 5,523 288133 19549 1,29 5,3 4 3,771 288772 28838 1,35 5,524 287554 19531 1,28 5,3 5 3,779 290372 28971 1,35 5,533 290155 19637 1,30 5,3 6 3,771 289728 28905 1,35 5,526 288841 19564 1,29 5,3 TB 3,772 289183 28870 1,35 5,524 288999 19569 1,29 5,3 RSD 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,3% 0,2% 0,3% - Giá trị diện tích, chiều cao, tR của các pic đồng phân ATN đều có độ lặp lại tốt (RSD < 1%). Hai pic S- và R-ATN tách hoàn toàn với độ phân giải trung bình > 5,0 chứng tỏ hệ thống HPLC ổn định và phù hợp để định tính, định lượng đồng thời các ĐPĐQ của ATN.
c. Tính chọn lọc – đặc hiệu Chuẩn bị các dung dịch sắc ký:
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg chất chuẩn R,S-ATN (hoặc 25 mg chất chuẩn S-ATN, R-ATN). Hoà tan các chất chuẩn bằng vừa đủ 100 ml MeOH.
Lọc, pha loãng 5 ml dịch lọc với pha động vừa đủ 50 ml để thu được dung dịch chuẩn tương ứng (nồng độ R-ATN, S-ATN và R,S-ATN tương ứng chính xác khoảng 0,025; 0,025 và 0,05 mg/ml).
- Mẫu thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng 50 mg ATN (hoặc 25 mg S- ATN) cho vào bình định mức 100ml, hòa tan bằng MeOH. Lọc, pha loãng 5 ml dịch lọc với pha động vừa đủ 50 ml để thu được dung dịch thử.
- Mẫu giả dược: Hòa tan lượng bột giả dược tương đương với 1 viên trong 100 ml methanol. Lọc, pha loãng 5 ml dịch lọc với pha động vừa đủ 50 ml.
Tiến hành sắc ký các dung dịch bằng phương pháp HPLC đã xây dựng ở Mục 3.1.2.1.
Sắc ký đồ các mẫu chuẩn R,S-ATN, R-ATN, S-ATN; mẫu thử và mẫu giả dược được trình bày ở Hình 3.15. Kết quả so sánh phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn (racemic) được trình bày ở Hình 3.16.
a. SKĐ chuẩn R-ATN b. SKĐ chuẩn R,S-ATN
c. SKĐ chuẩn S-ATN d. SKĐ thử R,S-ATN
e. SKĐ mẫu placebo f. SKĐ thử S-ATN
Hình 3.15. Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp HPLC phân tích các đồng phân đối quang atenolol
Hình 3.16. So sánh phổ UV của các pic trong mẫu thử và chuẩn R,S-Atenolol Trên sắc đồ mẫu placebo, trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu từ 2,5 đến 8,0 phút không xuất hiện pic (Hình 3.15e). SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN xuất hiện hai pic tách nhau hoàn toàn, độ phân giải giữa hai pic > 5 (Hình 3.15b) và thời gian lưu của các pic lần lượt là 3,8 và 5,5 phút tương ứng với thời gian lưu của các pic R- ATN và S-ATN trong SKĐ các dung dịch chuẩn R-ATN (Hình 3.15a) và S-ATN (Hình 3.14c). SKĐ dung dịch thử R,S-ATN (Hình 3.15d) xuất hiện hai pic, tách nhau hoàn toàn và tương ứng về thời gian lưu so với các pic S-ATN và R-ATN trong SKĐ các dung dịch chuẩn (Hình 3.15a, 3.15b và 3.15c). SKĐ mẫu thử S-ATN (Hình 3.15f) chỉ có một pic có thời gian lưu trùng với pic S-ATN trong SKĐ các dung dịch chuẩn S-ATN (Hình 3.14c) và R,S-ATN (Hình 3.15b). Phổ UV tại các thời điểm trùng với đỉnh các pic trong SKĐ mẫu thử R,S-ATN tương tự nhau và tương tự với phổ UV tại các thời điểm tương ứng trong SKĐ mẫu chuẩn R,S-ATN với hệ số chồng phổ xấp xỉ 1,00 (Hình 3.16). Độ tinh khiết của các pic R-ATN, S-ATN trên SĐK các mẫu chuẩn và thử đều có hệ số tinh khiết > 0,999. Như vậy phương pháp phân tích có độ chọn lọc-đặc hiệu cao và điều kiện sắc ký phù hợp cho việc phân tích các ĐPĐQ của ATN.
d. Khoảng nồng độ tuyến tính
Chuẩn bị dóy dung dịch chuẩn ATN racemic cú nồng độ 5 – 100 àg/ml (tương đương từ 10% đến 200% nồng độ định lượng) bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với pha động theo các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký, mỗi mức nồng độ phân tích 3 lần, xác định diện tích pic trung bình của các lần sắc ký. Phân tích hồi quy
Chú thích:
1/ Phổ UV pic S-ATN mẫu thử ATN racemic 2/ Phổ UV pic R-ATN mẫu thử ATN racemic 3/ Phổ UV pic R-ATN mẫu chuẩn ATN racemic 4/ Phổ UV pic S-ATN mẫu chuẩn ATN racemic
mối tương quan và hệ số tương quan (r) giữa diện tích pic (y) và nồng độ dược chất có trong mẫu (x) bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp trình bày ở Bảng 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dược chất được trình bày ở Hình 3.17.
Bảng 3.7. Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp HPLC
Mẫu chuẩn R-Atenolol S-Atenolol
Nồng độ (àg/ml) Spic (mAU.s) Nồng độ (àg/ml) Spic (mAU.s)
S1 2,512 30180 2,512 29850 S2 5,024 59134 5,023 58939
S3 10,047 118262 10,047 118607
S4 25,118 290873 25,117 290755
S5 40,189 468738 40,187 468422
S6 50,236 581303 50,234 583468
Phân tích HQ
y = 11573,38x + 1295,43 r = 1,000
y = 11604,81x + 868,12 r = 1,000
Hình 3.17. Đồ thị tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ R-ATN (trái) và S-ATN (phải)
Kết quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ từ 2,50 – 50,0 àg/ml cú mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa giá trị diện tích các pic S-ATN hoặc R-ATN trên SKĐ với giá trị nồng độ tương ứng của mỗi chất trong mẫu. Đường hồi quy có dạng đường thẳng với hệ số tương quan tuyến tính r lớn hơn 0,999.
e. Độ chụm của phương pháp HPLC
Độ lặp lại trong ngày: Tiến hành chuẩn bị các mẫu chuẩn và thử như dưới đây.
- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg chất chuẩn ATN cho vào bình định mức 100 ml. Hoà tan trong MeOH. Lọc, pha loãng dịch lọc với pha động để thu được dung dịch chuẩn ATN cú nồng độ khoảng 50 àg/ml .
- Mẫu thử: Cân chính xác một lượng bột viên Atenolol Stada 50mg tương ứng 50 mg ATN (KLTB viên = 150,3 mg) vào bình định mức 100 ml, hòa tan bằng MeOH. Lọc, pha loãng 5 ml dịch lọc với pha động vừa đủ 50 ml.
Phân tích các mẫu theo phương pháp đã được lựa chọn trong cùng một điều kiện.
Ghi lại các SKĐ và xác định nồng độ các ĐPĐQ của ATN có trong mỗi mẫu thử. Độ chính xác trong ngày của phương pháp được đánh giá bằng giá trị RSD giữa các kết quả phân tích.
Kết quả xác định độ chính xác trong ngày của phương pháp trình bày ở Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Độ lặp lại trong ngày của phương pháp HPLC
Stt Khối lượng cân mẫu thử (mg)
R–Atenolol S–Atenolol
Diện tích pic (mAU.s)
Hàm lượng (mg/viên)
Diện tích pic (mAU.s)
Hàm lượng (mg/viên) 1 150,7 289499 25,0 289445 25,0 2 151,1 293260 25,3 291885 25,2 3 150,6 288092 24,9 287476 24,9 4 150,9 288365 24,9 288038 24,8 5 150,3 288715 25,0 288451 25,0 6 150,6 294110 25,4 292954 25,3
Trung bình 25,1 25,0
RSD (%) 0,9 (n = 6) 0,7 (n = 6)
Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy độ lặp lại kết quả định lượng các đồng phân R-ATN và S-ATN trong mẫu thuốc đều có giá trị RSD < 2,0%, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại trong ngày đáp ứng yêu cầu.
Độ tái lặp giữa các ngày: Phân tích xác định hàm lượng các ĐPĐQ của ATN trong mẫu thử ở các ngày khác nhau. Cách tiến hành phân tích xác định hàm lượng dược chất trong mẫu thử ở mỗi ngày tương tự như độ chính xác trong ngày. Độ chính xác khác ngày được xác định bằng giá trị RSD kết quả phân tích các ngày.
Kết quả xác định độ chính xác khác ngày của phương pháp trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Độ tái lặp của phương pháp HPLC
Stt
Hàm lượng R-Atenolol (mg/viên)
Hàm lượng S-Atenolol (mg/viên)
Trong ngày Khác ngày Trong ngày Khác ngày
1 25,0 24,9 25,0 24,8 2 25,3 25,2 25,2 25,1 3 24,9 24,8 24,9 24,8 4 24,9 24,9 24,8 24,9 5 25,0 24,8 25,0 24,8 6 25,4 25,3 25,3 25,2 Trung bình 25,0 (n = 12) 25,0 (n = 12)
RSD (%) 0,8 0,7
Kết quả phân tích ở Bảng 3.9 cho thấy độ lặp lại kết quả định lượng các đồng phân R- và S-ATN đều có giá trị RSD < 2,0%, chứng tỏ phương pháp có độ tái lặp giữa các ngày đạt yêu cầu.
f. Độ đúng của phương pháp HPLC
Tiến hành thẩm định độ đúng theo phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo. Lượng chất chuẩn thêm vào ở 3 mức nồng độ tương ứng với 80, 100 và 120% nồng độ định lượng. Mỗi mức nồng độ gồm có 3 mẫu độc lập.
Các mẫu cần chuẩn bị cho thực nghiệm đánh giá độ đúng của phương pháp được chuẩn bị như sau:
- Mẫu chuẩn ATN có nồng độ 0,05 mg/ml.
- Mẫu placebo có thêm chuẩn (mẫu tự tạo): Cân lượng bột giả dược khoảng 100 mg (tương đương với khối lượng trung bình viên trừ đi khối lượng hoạt chất ghi nhãn) vào bình định mức 100ml. Thêm chính xác khoảng 40 đến 60 mg chất chuẩn ATN vào bình. Hòa tan và pha loãng bằng MeOH đến vừa đủ thể tích.
Chuyển 5,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, làm đầy bằng pha động.
Lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 àm.
Phân tích các mẫu theo phương pháp HPLC đã xây dựng và xác định hàm lượng dược chất có trong mẫu. Độ đúng là tỷ lệ % hoạt chất xác định được so với lượng hoạt chất thêm vào các mẫu. Kết quả xác định độ đúng của phương pháp đối với từng ĐPĐQ được trình bày ở Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Độ đúng của phương pháp HPLC Số
thứ tự
R-Atenolol Khối lượng chuẩn
thêm vào (mg)
Diện tích pic (mAU.s)
Lượng chuẩn tìm lại (mg)
Độ đúng (%)
1 20,0 234574 19,7 98,5
2 20,1 236414 19,9 99,0
3 19,9 235414 19,8 99,3
4 24,8 291561 24,5 98,7
5 24,8 290575 24,4 98,6
6 24,9 290823 24,4 98,1
7 30,1 355253 29,9 99,1
8 30,0 353767 29,7 99,1
9 30,2 354999 29,8 98,9
Trung bình (n = 9) 98,8
RSD (%) 0,4
S-Atenolol
1 20,0 234147 19,7 98,4
2 20,1 235903 19,9 98,9
3 19,9 235708 19,8 99,6
4 24,8 289423 24,4 98,1
5 24,8 289646 24,4 98,4
6 24,9 290666 24,5 98,2
7 30,1 354984 29,9 99,2
8 30,0 352357 29,6 98,8
9 30,2 353967 29,8 98,7
Trung bình (n = 9) 98,7
RSD (%) 0,5
Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng cao với tỉ lệ tìm lại từ 98,1% đến 99,6%
(trung bình 98,8% đối với R-ATN và 98,7% đối với S-ATN) đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích.
g. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Pha loóng mẫu chuẩn chứa R-ATN và S-ATN nồng độ chớnh xỏc khoảng 2,5 àg/ml (mẫu có nồng độ thấp nhất trong đường chuẩn – Bảng 3.7) với các hệ số pha loãng lần lượt là 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32… và tiến hành sắc ký theo phương pháp đã xây dựng.
Kết quả phân tích mẫu pha loãng 1/32, giá trị tín hiệu/nhiễu (S/N) < 3, hệ thống