1) Xây dựng thành công các phương pháp phân tích ATN và ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc và trong HT người
Lần đầu tiên tại Việt Nam đã xây dựng thành công các phương pháp phân tích ATN và ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc và trong huyết tương người, cụ thể như sau:
Phương pháp CE định lượng các đồng phân đối quang ATN trong chế phẩm:
- Cột mao quản silica nung chảy kớch thước 48,5 cm ì 50 àm (chiều dài hiệu dụng 40 cm). Nhiệt độ mao quản: 25 C. Điện thế hai đầu mao quản 25 kV.
- Dung dịch điện ly nền: Đệm TRIS 50 mM có pH 4,0 chứa tác nhân chọn lọc hoạt quang CM-β-CD 8mM.
- Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar × 3 s. Đầu dò DAD, λ = 194 nm.
Phương pháp HPLC định lượng các đồng phân đối quang ATN trong chế phẩm:
- Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; 5 àm) chứa pha tĩnh chọn lọc hoạt quang cellobiohydrolase, ổn định ở 25 C, có bảo vệ cột.
- Pha động: Isopropanol – dung dịch amoni acetat 10 mM pH 5,9 tỷ lệ 10:90. Tốc độ dòng 0,7 ml/phút.
- Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl. Đầu dũ DAD, = 230 nm.
Các phương pháp phân tích ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc đã được thẩm định và đạt yêu cầu của Dược điển Việt Nam, Anh, Mỹ và nhiều nước, tổ chức khác [4], [130], [186].... Phương pháp CE nghiên cứu trong luận án có thời gian phân tích được rút ngắn từ 2 – 4 lần so với phương pháp CE phân tích các đồng phân đối quang ATN của Wei Wang [195] và Wuhong Li [201]. So với một số phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc đã được công bố [42], [44], [136], [158], [163], [188], phương pháp HPLC nghiên cứu trong luận án có thời gian phân tích ngắn hơn khoảng 1,5 – 4 lần; Rs lớn hơn 1,5 – 2,5 lần và LOD, LOQ nhỏ hơn khoảng 4 – 50 lần. Với giá trị LOQ nhỏ, phương pháp HPLC đã nghiên cứu phù hợp để xác định hàm lượng tạp chất đối quang R-ATN có trong các mẫu nguyên liệu, thuốc S-ATN ở cả mức giới hạn nhỏ hơn 0,1%.
Phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN và ĐPĐQ trong huyết tương người:
Điều kiện khối phổ: Phổ khối MS/MS, nguồn ESI (+). Các thông số của thiết bị:
Phương pháp
Thông số
Phân tích
đồng phân đối quang của ATN
Phân tích ATN toàn phần R-ATN S-ATN Esomeprazol
(IS) ATN Diltiazem (IS) Điện thế nguồn phun 3200 V 3200 V 3200 V 3200 V 3200 V Nhiệt độ nguồn phun 200 oC 200 oC 200 oC 50 oC 50 oC Áp suất khí mang 40 psi 40 psi 40 psi 20 psi 20 psi Áp suất khí bổ trợ 5 psi 5 psi 5 psi 5 psi 5 psi Áp suất khí quét ion 1 psi 1 psi 1 psi 1 psi 1 psi Nhiệt độ mao quản 360 oC 360 oC 360 oC 360 oC 360 oC Ion ban đầu, m/z 267,0 267,0 346,1 267,0 415,1
Thế phân mảnh ion 17 V 17 V 11 V 17 V 22 V
Ion tạo thành, m/z 190,0 190,0 198,0 190,0 178,1
Quy trỡnh xử lý mẫu huyết tương: Lấy 1,0 ml HT, thờm 50 àl dung dịch nội chuẩn và 500 àl NH4OH 0,1M. Lắc xoỏy, sau đú chiết với 5,0 ml chloroform. Lắc cơ học 15 phút, ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút. Lấy 3,0 ml lớp chloroform, cô bay hơi dung môi dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC đến cắn. Hòa cắn trong 1 ml pha động và sắc ký.
Điều kiện sắc ký:
Phương pháp định lượng ATN toàn phần:
- Cột C18 (2,0 x 50 mm; 1,8 àm) ổn định ở 40 C, cú bảo vệ cột.
- Pha động: Acetonitril – dung dịch amoni acetat 2 mM tỷ lệ 70 : 30 (v/v). Tốc độ
0,2 ml/phút.
- Thể tớch tiờm mẫu: 5 àl. Nhiệt độ bộ phận tiờm mẫu: 4 oC
Phương pháp định lượng các đồng phân đối quang của ATN:
- Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; 5àm) ổn định ở 25 C, cú bảo vệ cột.
- Pha động: Isopropanol – dung dịch amoni acetat 10 mM pH 5,9 tỷ lệ 10:90 (v/v). Tốc độ 0,7 ml/phút.
- Thể tớch tiờm mẫu: 5 àl. Nhiệt độ bộ phận tiờm mẫu: 4 oC.
Các phương pháp LC-MS/MS đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng yêu cầu của Mỹ, châu Âu đối với một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [68], [184]. So với các phương pháp định lượng ATN trong dịch sinh học đã được công bố [21], [134], [149], [173], [204] phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu trong luận án có LOD, LOQ cũng như LLOQ thấp hơn tới hàng chục lần. Với giá trị LLOQ nhỏ, phương pháp xác định được chính xác nồng độ ATN trong các mẫu huyết tương của NTN và bệnh nhân ở nhiều thời điểm khác nhau sau khi sử dụng thuốc, phù hợp cho các nghiên cứu SKD và TSSH các thuốc ATN. Phương pháp LC- MS/MS phân tích đồng thời các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương trình bày ở luận án, lần đầu được công bố và có thời gian phân tích ngắn hơn; độ phân giải giữa các pic đồng phân lớn hơn (Rs > 5); giá trị LOD, LOQ nhỏ hơn nhiều lần so với các phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ trong dịch sinh học đã công bố trước đây.
2) Ứng dụng các phương pháp phân tích ATN và ĐPĐQ trong kiểm tra chất lượng và nghiên cứu SKD các thuốc ATN:
Kết quả xác định hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN trên 4 mẫu thuốc viên nén chỉ chứa một đồng phân đối quang S-ATN lần đầu được công bố cho thấy chỉ tiêu giới hạn tạp chất và chất lượng của các thuốc S-ATN đang lưu hành trên thị trường không giống nhau. Trong số các mẫu thuốc nghiên cứu có sản phẩm tiêu chuẩn chất lượng không có chỉ tiêu, phương pháp thử xác định giới hạn hoặc hàm lượng tạp chất đối quang và kết quả phân tích có hàm lượng tạp chất đối quang trên 2%, vượt mức quy định chung. Do vậy, để đảm bảo chất lượng các thuốc S-ATN đang lưu hành cũng như đảm bảo công bằng trong thương mại, cần thiết phải kiểm tra đánh giá chất lượng các thuốc đơn đồng phân ATN nói riêng và các thuốc đơn đồng phân khác nói chung bằng phương pháp phân tích ĐPĐQ thích hợp.
Cho đến nay, mới chỉ có các nghiên cứu SKD, TĐSH của ATN toàn phần được công bố. Các số liệu SKD và DĐH của các đồng phân đối quang S-ATN và R-ATN
trên NTN Việt Nam chưa từng được công bố. Kết quả nghiên cứu SKD một số thuốc ATN đang lưu hành cho thấy, SKD của các đồng phân đối quang S-ATN và R-ATN ở NTN Việt Nam là tương tự nhau, không có sự chuyển đổi giữa các dạng ĐPĐQ của ATN trên lâm sàng.
Sinh khả dụng của S-ATN ở các thuốc chỉ chứa một thành phần đối quang có xu hướng cao hơn so với thuốc racemic (chứa cả hai ĐPĐQ với tỷ lệ bằng nhau). Thuốc ATN racemic do Việt Nam sản xuất nhiều khả năng TĐSH với thuốc biệt dược gốc và các thuốc S-ATN đang lưu hành trên thị trường nhiều khả năng không TĐSH với nhau. Do vậy, để đảm bảo chất lượng, hiệu quả điều trị của thuốc ATN đang lưu hành trên thị trường nói riêng và các thuốc chứa dược chất đối quang có tác dụng dược lý không giống nhau nhưng hiện đang tồn tại ở cả dạng racemic và dạng chế phẩm chỉ chứa một đồng phân có tác dụng dược lý (tương tự như ATN và S-ATN) nói chung cần thiết phải triển khai các nghiên cứu SKD, đánh giá TĐSH các thuốc này bằng các phương pháp phân tích ĐPĐQ trong dịch sinh học phù hợp.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Đề tài “Nghiên cứu định lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học” đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu để đạt được các mục tiêu đề ra.
1. Đã xây dựng được phương pháp HPLC và CE định lượng đồng thời các đồng phân đối quang atenolol trong một số chế phẩm thuốc, trong đó:
Phương pháp HPLC: Phân tách các ĐPĐQ bằng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang có bản chất là cellobiohydrolase và pha động chứa 2-propanol – đệm amoni acetat 10 mM, pH 5,9 tỷ lệ 10 : 90 (v/v), tốc độ dòng 0,7 ml/phút.
Phương pháp CE: Phân tách các ĐPĐQ trên cột mao quản silica nung chảy kích thước 48,5 cm ì 50 àm, chiều dài hiệu dụng 40 cm với điện thế hai đầu mao quản 25 kV và dung dịch điện ly nền là đệm TRIS 50 mM, pH 4 chứa CM-β-CD 8 mM.
Các phương pháp đã được thẩm định theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Việt Nam và nhiều nước, tổ chức khác. Kết quả thẩm định các phương pháp có độ đặc hiệu chọn lọc, độ đúng, độ chính xác, khoảng tuyến tính đạt yêu cầu và phù hợp để định lượng đồng thời các đồng phân đối quang S-ATN và R-ATN trong chế phẩm thuốc. Phương pháp HPLC có giới hạn định lượng nhỏ (0,27 ng/ml) phù hợp để xác định hàm lượng tạp chất đối quang R-ATN có trong các mẫu thuốc và nguyên liệu S-ATN ở mức giới hạn nhỏ hơn 0,1%.
2. Đã xây dựng được các phương pháp LC-MS/MS định lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong huyết tương người, trong đó:
Phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần: Chiết ATN trong các mẫu HT bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform sau khi đã kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 0,1M. Phân tích dịch chiết bằng HPLC với cột pha đảo C18 và xác định nồng độ ATN trong mẫu bằng phương pháp MS/MS với nguồn ion hóa ESI (+) đã được tối ưu hóa để phân tích cặp ion mẹ - con có tỷ số m/z = 267 và 190 đặc trưng cho ATN.
Phương pháp LC-MS/MS định lượng các đồng phân đối quang ATN trong HT: Xử lý mẫu HT bằng dung môi chloroform sau khi kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 0,1M. Phân tách các ĐPĐQ trong dịch chiết bằng phương pháp HPLC với cột sắc
ký Chiralpak CBH chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolase. Phân tích phổ khối MS/MS với nguồn ion hóa ESI (+) đã được tối ưu hóa cho ATN và nội chuẩn esomeprazol. Định lượng ATN trong mẫu dựa trên kết quả phân tích khối cặp ion mẹ - con có số khối 267 190 Da.
Các phương pháp phân tích đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng các yêu cầu của Mỹ, Châu Âu đối với một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học đồng thời ứng dụng phù hợp trong nghiên cứu SKD và TĐSH chế phẩm thuốc ATN.
3. Đã ứng dụng các phương pháp phân tích kiểm tra chất lượng và nghiên cứu sinh khả dụng một số chế phẩm thuốc ATN đang lưu hành:
Phân tích các đồng phân đối quang trong một số thuốc bằng HPLC và CE
- Phân tích xác định hàm lượng ATN và các ĐPĐQ trong 08 mẫu thuốc (4 mẫu racemic và 4 mẫu S-ATN) bằng các phương pháp HPLC và CE. Các phương pháp có độ đúng, độ chính xác tương đương nhau. Các mẫu thuốc đạt yêu cầu.
- Phân tích xác định hàm lượng tạp R-ATN trong 04 mẫu chế phẩm thuốc S-ATN bằng phương pháp HPLC. Ba mẫu thuốc có giới hạn tạp đạt yêu cầu và một mẫu thuốc có giới hạn tạp chất R-ATN vượt quá mức giới hạn chung 2,0%.
- Áp dụng phương pháp HPLC định lượng ATN và các đồng phân hòa tan trong nghiên cứu so sánh độ hòa tan in vitro các thuốc ATN. Bốn mẫu thuốc (2 mẫu racemic và 2 mẫu S-ATN) có độ hòa tan in vitro tương đương nhau.
Phân tích các đồng phân đối quang ATN trong HT người tình nguyện và bệnh nhân - Phương pháp LC-MS/MS phù hợp để định lượng ATN và các ĐPĐQ trong các mẫu HT bao gồm 504 mẫu HT của 18 NTN và 23 mẫu huyết tương của 08 bệnh nhân điều trị các bệnh tim mạch, huyết áp.
- Từ kết quả phân tích, đã xác định được các đồng phân S- và R-ATN có SKD tương tự nhau và không có sự chuyển dạng hỗ biến giữa các dạng ĐPĐQ của ATN trên lâm sàng. Sinh khả dụng thuốc S-ATN trên NTN lần đầu được công bố và có khác biệt về mức độ hấp thu (Cmax, AUC) so với thuốc ATN racemic. Hai thuốc ATN racemic có Cmax, Tmax, AUC tương tự nhau còn hai thuốc S-ATN có Cmax, AUC không giống nhau.
KIẾN NGHỊ
Cho đến nay, phân tích các thuốc chứa ĐPĐQ vẫn là một chủ đề khó trong lĩnh vực kiểm nghiệm và đánh giá SKD, TĐSH. Tuy vậy, sự phát triển các thuốc chứa dược chất đối quang đã và đang là một xu hướng phát triển của ngành dược. Để đảm bảo và nâng cao chất lượng các thuốc chứa dược chất đối quang nói chung và atenolol nói
riêng đang lưu hành trên thị trường, nên tiến hành một số việc sau:
1) Áp dụng phương pháp HPLC phân tích các ĐPĐQ của ATN kiểm tra giới hạn tạp R-ATN đối với các thuốc S-ATN đang lưu hành;
2) Nghiên cứu đánh giá TĐSH các thuốc S-ATN; R,S-ATN và so sánh SKD các thuốc S-ATN với thuốc biệt dược gốc ATN racemic để đảm bảo chất lượng, hiệu quả điều trị trên lâm sàng của các thuốc.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
1. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013), “Nghiên cứu tách các đồng phân quang học của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang”, Tạp chí nghiên cứu dược và thông tin thuốc, số 6/2013, trang 218-224.
2. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013), “Bước đầu nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng phương pháp điện di mao quản”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 11, số 42, trang 14-19.
3. Tạ Mạnh Hùng, Phan Thị Nghĩa, Trịnh Văn Lẩu (2014), “Nghiên cứu định lượng atenolol trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 12, số 44, trang 2-7.
4. Tạ Mạnh Hùng, Ngô Minh Thúy, Vũ Ngân Bình, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thị Kiều Anh (2014), “Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản”, Tạp chí nghiên cứu dược và thông tin thuốc, số 6/2014, trang 212-217.
5. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2015), “Nghiên cứu định lượng đồng thời các đồng phân quang học của atenolol trong một số chế phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC-DAD”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 13, số 49, trang 16-23.
6. Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2016), “Nghiên cứu định lượng đồng thời các đồng phân quang học của atenolol trong huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS”. Tạp chí Dược học, số 482, trang 56-60.