1.2. PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
1.2.2. Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký – khối phổ
có nồng độ dược chất ở ngưỡng thấp (ng/ml), hiện nay người ta hay sử dụng phương pháp phân tích khối phổ (MS), đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC- MS/MS) vì phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao [112], [145], [148].
1.2.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ
Phương pháp phân tích phổ khối lượng (MS) là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý của phương pháp phân tích khối phổ được trình bày ở Hình 1.15.
Hình 1.15. Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị khối phổ [46]
Tùy thuộc vào cấu tạo của chất cần phân tích và cơ chế, kỹ thuật ion hóa được sử dụng mà chất cần phân tích có trong mẫu có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểu phân tích điện hoặc bị phân mảnh, bẻ gẫy cấu trúc phân tử để hình thành các ion hoặc các tiểu phân mang điện có khối lượng nhỏ hơn. Hỗn hợp các ion, tiểu phân mang điện hình thành ở nguồn ion, được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân tích khối. Dưới tác động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác nhau sẽ chuyển động có hướng với tốc độ và quỹ đạo chuyển động khác nhau. Tốc độ, quỹ đạo chuyển động của ion phụ thuộc vào cường độ điện trường của bộ phận phân tích khối; điện tích và khối lượng của ion. Do vậy, sau khi phân tích khối, các ion trong hỗn hợp sẽ được phân tách riêng thành từng loại. Mỗi loại ion được phân tách sẽ được bộ phận phát hiện ghi nhận thành từng vạch phổ tương ứng trên phổ đồ [46], [55], [103].
Đối với hợp chất hữu cơ, sự ion hoá phân tử trung hoà ban đầu thành các ion/phân tử mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao như chùm electron hay các gốc tự do… xảy ra theo một trong các cách như sau:
+ Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích:
ABCD + e ABCD+ + 2e (> 95%) hoặc ABCD + e ABCD-
+ Phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích:
ABCD + e* ABn+ + C + Dm-
Năng lượng ion hoá là một yếu tố quyết định sự phân mảnh của các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu bằng với năng lượng ion hóa phân tử (khoảng 10 eV) sẽ gây nên sự ion hóa phân tử. Nếu năng lượng ion hóa lớn sẽ bẻ gẫy một số hoặc toàn bộ các liên kết trong phân tử tạo ra nhiều mảnh, ion hoặc phân tử trung hòa có khối lượng bé hơn. Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của mỗi phân tử và là cơ sở để nhận dạng, định danh, định tính chất cần phân tích bằng phương pháp MS [16], [46], [103].
1.2.2.2. Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ
Một thiết bị phân tích MS bao gồm các bộ phận chính: bộ nạp mẫu (inlet), bộ nguồn ion hoá (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện – đếm lượng ion (detector – đầu dò) và bộ phận ghi/xử lý số liệu (data system).
- Bộ phận nạp mẫu: Chuyển mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị MS.
Tùy thuộc vào trạng thái vật lý của mẫu cần phân tích mà có thể nạp mẫu trực tiếp vào thiết bị MS hoặc nạp mẫu vào MS gián tiếp thông qua các thiết bị phân tích kết hợp, ghép nối như GC, HPLC hoặc CE. Căn cứ vào thiết bị phân tích ghép nối, mà người ta chia thành các phương pháp như GC-MS, LC-MS hay CE-MS [9], [46], [103].
- Nguồn ion hoá: Nơi diễn ra quá trình chuyển các hoạt chất cần phân tích thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau. Các ion tạo thành sẽ được tăng tốc độ, thu gọn (hội tụ) để đi vào bộ phận phân tích phổ khối, còn những tiểu phân, dung môi… không bị ion hóa, không mang điện sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS. Có nhiều loại nguồn ion hoá, sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác nhau được dùng trong các thiết bị MS như: ion hóa va chạm điện tử; ion hóa điện trường, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization)… Tùy thuộc đặc điểm của chất cần phân tích, đặc điểm của thiết bị phân tích ghép nối mà các nguồn ion hóa với các kỹ thuật ion hóa khác nhau được lựa chọn [9], [46], [103].
- Bộ phân tích khối: Tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của điện trường. Bộ phận phân tích khối của thiết bị MS gồm nhiều loại/kiểu như: cung từ, tứ cực, tứ cực chập ba, bẫy ion, phân tích thời gian bay, phân
tích cộng hưởng ion biến đổi chuỗi (FT-ICR). Các bộ phân tích khối có cấu tạo không giống nhau, nhưng đều hoạt động dựa trên nguyên lý cung cấp một điện trường biến thiên với tần số xác định để điều chỉnh quỹ đạo và tốc độ chuyển động của các ion trên cơ sở đó phân tách các ion có tỷ số m/z khác nhau [46], [52], [103]. Hiện nay, để tăng cường độ nhạy, độ phân giải và/hoặc độ chính xác phổ khối, một số thiết bị MS hiện đại có bộ phân tích khối kiểu Hybrid, ghép nối giữa hai hoặc nhiều bộ phân tích khối nêu trên với nhau [74], [81], [174]. Các thiết bị MS kiểu tứ cực chập ba, bẫy ion và FT-ICR có thể tiến hành phân tích phổ khối lượng 2 hoặc nhiều lần (MS/MS) trong đó lần phân tích khối thứ nhất lựa chọn ion ban đầu (ion mẹ) với m/z xác định, lần phân tích khối tiếp theo xác định số khối của các ion tạo thành (ion con) khi phân mảnh ion mẹ. Các thiết bị MS kiểu tứ cực, cung từ, đo thời gian bay chỉ phân tích phổ khối được một lần [46], [52], [103].
1.2.2.3. Định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng LC-MS/MS với nguồn ESI Phương pháp GC ứng dụng chủ yếu để phân tích các hợp chất dễ bay hơi, bền với nhiệt và không phân cực [17], [19], [86] còn phương pháp LC có thể phân tách hiệu quả phần lớn các chất dựa trên sự tương tác giữa hoạt chất, pha tĩnh và dòng dung môi pha động. Đa số các dược chất, chất chuyển hóa cần phân tích trong các mẫu dịch sinh học đều là các hợp chất có khối lượng phân tử trung bình hoặc nhỏ, khó bay hơi, có tính phân cực hoặc ít phân cực, chỉ có một số ít là các hợp chất dễ bay hơi và không phân cực. Do vậy, phạm vi ứng dụng phân tích thuốc trong dịch sinh học của phương pháp LC-MS rộng rãi hơn so với phương pháp GC-MS [17], [82], [122], [197].
Tóm tắt so sánh một số đặc điểm và phạm vi ứng dụng của các thiết bị GC và LC khi kết nối với MS được trình bày ở Bảng 1.9 [46], [55], [148].
Bảng 1.9. Tóm tắt đặc điểm, phạm vi áp dụng của phương pháp GC-MS và LC-MS GC-MS:
• Hợp chất bay hơi; bền với nhiệt;
có khối lượng phân tử nhỏ đến trung bình;
• Hợp chất phân cực thấp;
• Lưu lượng khí 1 – 5 ml/phút;
• Nguồn ion hóa năng lượng cao (EI; gây phân mảnh tại nguồn ion).
LC-MS:
• Hợp chất không bay hơi, không bền nhiệt;
có thể phân tích các hợp chất có khối lượng phân tử lớn như protein, peptid, polyme…
• Hợp chất phân cực trung bình đến cao;
• Tốc độ dòng 0,1 – 1,0 ml/phút;
• Ion hóa áp suất thường năng lượng thấp (ESI, APCI; ion hoá mềm, không gây phân mảnh tại nguồn ion)
Trong số các phương pháp LC-MS, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba (LC-MS/MS hoặc HPLC-MS/MS) với nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) có độ đặc hiệu-chọn lọc tốt và độ nhạy cao thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch sinh học [145], [197]. Nhiều phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng LC-MS/MS với nguồn ESI đã được công bố trong những năm gần đây cả ở Việt Nam và trên thế giới [6], [10], [15], [126], [190], [191]… Phương pháp LC-MS/MS sử dụng nguồn ESI có độ đặc hiệu- chọn lọc và độ nhạy tốt là do kết hợp các ưu điểm của cả thiết bị ghép nối HPLC, và thiết bị phân tích phổ khối hai lần với nguồn ESI. Cơ chế hoạt động của thiết bị LC- MS/MS với nguồn ESI như sau:
- HPLC: phân tách (một phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có trong dịch sắc ký, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với hoạt chất đi vào nguồn ESI. Việc giảm số lượng các tiểu phân có mặt tại nguồn ion làm tăng hiệu suất ion hóa hoạt chất cần phân tích, do đó góp phần tăng độ nhạy của phương pháp [31], [141], [145].
- Trong nguồn ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Nguồn ESI, với kỹ thuật ion hóa mềm, nhiễm điện bề mặt nên có thể áp dụng để ion hóa nhiều hoạt chất với các đặc điểm hóa lý khác nhau [26], [46], [197].
- Phổ khối tứ cực kiểu chập ba: Gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3 có cấu tạo như Hình 1.16 [52].
Hình 1.16. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba.
Q1 sẽ phân tích khối lần thứ nhất lựa chọn ion ban đầu (ion mẹ) có số khối m/z xác định. Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2. Tại Q2, ion mẹ chuyển động Brown, va chạm với các phân tử khí argon được cung cấp bổ sung vào Q2 với một lượng xác định, điều chỉnh được để khống chế tần suất va chạm.
Nhờ va chạm, năng lượng động học của các ion được chuyển thành nội năng để phân mảnh ion mẹ tạo ra các ion con. Các ion con hình thành tiếp tục được phân tích khối và tách riêng thành từng loại theo số khối tại Q3.
Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau. Vì vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp MS [46], [52], [197].
Trong phương pháp MS, để định tính một chất có thể tiến hành theo cách: So sánh phổ khối của chất cần phân tích với phổ khối của chất chuẩn phân tích trong cùng điều kiện hoặc so sánh phổ khối của chất cần phân tích với phổ khối chuẩn trong thư viện phổ.
Để định lượng, xác định nồng độ/hàm lượng của hoạt chất, có thể lựa chọn một hoặc một vài số khối đặc trưng cho hoạt chất cần phân tích, thường chỉ lựa chọn một số khối đặc trưng và có đáp ứng ổn định nhất trong quá trình phân tích (có thể là ion mẹ - phương pháp MS) hoặc một ion con (phương pháp MS/MS) và tiến hành so sánh cường độ của số khối này trong mẫu thử với cường độ của nó trong một hoặc nhiều mẫu chuẩn (mẫu chứa chất chuẩn) đã biết nồng độ/hàm lượng [16], [46], [52].