CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG HUYẾT TƯƠNG
3.2.1. Định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương bằng LC-MS/MS
3.2.1.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp
a. Nghiên cứu phân tích phổ khối lượng MS/MS của atenolol
Ion hóa atenolol và phổ khối MS
Phân tích phổ khối lượng mẫu dung dịch chuẩn ATN racemic trong MeOH có nồng độ khoảng 1,0 àg/ml trờn thiết bị LC-MS/MS với chế độ phõn tớch khối 1 lần, sử dụng nguồn ion hóa ESI ở chế độ điện tích dương và kỹ thuật ghi toàn phổ tại tứ cực Q1 (full scan).
Trên phổ đồ, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và ổn định với tỷ số m/z = 267 (Hình 3.21). Vạch phổ phù hợp với cấu trúc phân tử ATN (CTPT: C14H22N2O3, KLPT:
266,3 g/mol) nhận một proton và mang điện tích +1 ([ATN+H]+).
fchon nang luong_131125140137 #7 RT:0.06 AV:1 NL:3.03E7 T:+ p ESI Full ms2 267.223 [150.070-300.000]
160 180 200 220 240 260 280 300
m/z 0
20 40 60 80 100
Relative Abundance
267.30
185.22 202.80
166.81 235.71 249.93 268.98 296.71
Hình 3.21. Phổ khối MS dung dịch chuẩn atenolol
Tiến hành tối ưu hóa điện thế của “thấu kính hội tụ”, để các ion [ATN+H]+ hình thành ở nguồn ESI được “tập trung” và đi vào bộ phận phân tích khối với số lượng nhiều nhất trong một thời gian ngắn. Giản đồ mối quan hệ giữa điện thế “thấu kính hội tụ” và tỷ lệ tương đối số lượng ion có số khối 267 Da đi vào bộ phận phân tích khối được trình bày ở Hình 3.22.
Hình 3.22. Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 267 Da Kết quả trên giản đồ, ở mức điện thế 80V các ion [ATN+H]+ “hội tụ” đi vào bộ phận phân tích khối tối ưu nhất.
Phân mảnh ion ban đầu và phổ khối MS/MS của atenolol
Do đặc điểm có khả năng phân mảnh ion ban đầu tạo các ion con đặc trưng cho dược chất và thuận lợi khi phân tích nên kỹ thuật phân tích phổ khối 2 lần (MS/MS) được ứng dụng để giảm độ nhiễu do nền mẫu và tăng tính đặc hiệu, độ nhạy của phương pháp. Để phân mảnh ion ban đầu tạo ra các ion đặc trưng cho dược chất cần phân tích thì phải cung cấp các mức năng lượng phù hợp đối với mỗi dược chất.
Điều chỉnh mức năng lượng phân mảnh ion mẹ bằng cách cung cấp và kiểm soát lưu lượng khí argon đi vào tứ cực Q2 của thiết bị. Tại Q2, khí argon va chạm với các
ion mẹ. Năng lượng động năng được chuyển thành năng lượng phân mảnh ion. Sau khi phân mảnh ion mẹ, tiến hành phân tích khối lần thứ 2 tại tứ cực Q3 với chế độ ghi toàn phổ MS/MS, xác định số khối của các ion con tạo thành.
Phổ khối lượng MS/MS khi phân mảnh ion [ATN+H]+ được trình bày ở Hình 3.23.
fchon nang luong_131125140700 #22 RT:0.18 AV:1 NL:1.94E6 T:+ p ESI Full ms2 267.223 [150.070-300.000]
160 180 200 220 240 260 280 300
m/z 0
20 40 60 80 100
Relative Abundance
190.13
178.08 172.90
208.26
267.30 225.35
226.33 249.37 278.92 298.67
Hình 3.23. Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [ATN+H]+
Trên phổ đồ, trong số các ion con tạo thành, ion có tỷ số m/z = 190 có cường độ tín hiệu cao nhất, ổn định, lặp lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh ATN. Do vậy, cặp ion có m/z = 267 và 190 được lựa chọn cho các thực nghiệm tiếp theo. Quá trình phân mảnh ion ban đầu có m/z = 267 tạo thành các ion con có m/z = 190 phụ thuộc vào mức năng lượng được cung cấp. Hình 3.24 biểu diễn sự phụ thuộc giữa số lượng ion m/z = 190 tạo thành với mức năng lượng phân mảnh ion [ATN+H]+ ban đầu.
Hình 3.24. Giản đồ năng lượng phân mảnh [ATN+H]+ tạo ion có tỷ số m/z = 190.
Trên giản đồ, khi năng lượng phân mảnh lớn (trên 35V), ion [ATN+H]+ bị bẻ gẫy hầu hết các liên kết trong phân tử tạo ra các mảnh, tiểu phân hay ion có số khối nhỏ, ion có số khối 190 Da được tạo thành không nhiều. Khi mức năng lượng phân mảnh thấp (dưới 10 V), năng lượng cung cấp không đủ để phá vỡ các liên kết phân tử của ion [ATN+H]+ do vậy số lượng ion có m/z = 190 được tạo thành cũng không nhiều.
Mức năng lượng tối ưu để phân mảnh ion [ATN+H]+ có tỷ số m/z = 267 tạo thành ion con có tỷ số m/z = 190 Da là 17 V.
Từ kết quả thực nghiệm, xác định được điều kiện phổ khối MS/MS phân tích ATN như sau: Cặp ion đặc trưng cho phân tích ATN có số khối lần lượt là 267 Da (ion mẹ) và 190 Da (ion con). Điện thế hội tụ chùm ion mẹ là 80 V và năng lượng phân mảnh ion mẹ trên thiết bị MS tứ cực chập ba TSQ Ultra – Thermo Scientific là 17 V.
Nghiên cứu các điều kiện ion hóa atenolol ở nguồn ESI
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: điện thế, nhiệt độ đầu phun; lưu lượng khí nitrogen cung cấp cho nguồn tới hiệu suất ion hóa ATN tại nguồn ESI theo các nội dung đã trình bày ở Mục 2.3.2.1a. Kết quả khảo sát cho thấy:
- Khi điện thế đầu phun tăng, cường độ vạch phổ 267 Da tăng nhưng đồng thời xuất hiện nhiều vạch phổ có số khối khác (nhiễu đường nền tăng) và ngược lại. Khi điện thế tăng cao trên 4500 V thì có hiện tượng phóng hồ quang điện ở đầu phun ảnh hưởng đến hoạt động của thiết bị. Khi điện thế dưới 2500 V, thì cường độ vạch phổ 267 Da thấp, làm độ nhạy của phương pháp giảm.
- Khi đặt nhiệt độ đầu phun tăng lên, cường độ tín hiệu tăng lên và ngược lại. Nhưng khi nhiệt độ tăng cao trên 250 oC hoặc hạ thấp dưới 100 oC, cường độ tín hiệu thu được đều thấp và không ổn định.
- Khi áp suất dòng khí quá thấp (dưới 10 psi), có hiện tượng ngưng tụ hơi nước ở đầu phun nên cường độ tín hiệu thấp và không ổn định. Khi tăng áp suất dòng khí từ 10 psi đến 20 psi, cường độ tín hiệu cao lên. Tuy nhiên, khi áp suất dòng khí lớn (trên 20 psi) thì cường độ tín hiệu của dòng ion mẹ giảm và không ổn định, có thể do một phần ion mẹ bị thổi qua đường thải cùng với dung môi pha động, kết quả là làm giảm lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối.
Từ kết quả thực nghiệm, xác định được các thông số của nguồn ESI + tối ưu cho phân tích ATN là: Điện thế đầu phun: 3200 V; nhiệt độ đầu phun: 200 oC; áp suất khí mang, khí bổ trợ, khí quét ion lần lượt là 40 psi, 5 psi và 1 psi; nhiệt độ mao quản vận chuyển ion là 360 oC.
b. Nghiên cứu lựa chọn chuẩn nội của phương pháp phân tích
Khảo sát lựa chọn chuẩn nội với các dược chất: diltiazem.HCl, venlafaxin, diphenylhydramin.HCl, metoprolol, gliclazid, esomeprazol… Tối ưu hóa điều kiện khối phổ của từng chất nội chuẩn tương tự ATN (Mục 3.2.1.1).
Kết quả thực nghiệm cho thấy: Diltiazem, metoprolol và esomeprazol có các điều
kiện phổ khối khi phân tích tương tự ATN. Diphenylhydramin, venlafaxin và gliclazid khi phân tích phải sử dụng các điều kiện phổ khối riêng, không thể sử dụng một phương pháp LC-MS/MS để phân tích đồng thời ATN cùng với các chất này. Trong số các chất có chung điều kiện phổ khối với ATN, esomeprazol và diltiazem khi phân mảnh ion ban đầu bằng năng lượng va chạm đều tạo ra các mảnh phổ con bền vững, ổn định có cường độ tín hiệu cao thích hợp làm nội chuẩn cho phương pháp phân tích.
Từ kết quả thực nghiệm, kết hợp với các điều kiện sắc ký, quy trình xử lý mẫu huyết tương, esomeprazol (CTPT: C17H19N3O3S; KLPT: 345,4 g/mol) được lựa chọn làm chất nội chuẩn cho phương pháp LC-MS/MS phân tích các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương. Điều kiện MS phân tích chất nội chuẩn như sau: ion ban đầu có số khối 346 Da, năng lượng phân mảnh ion ban đầu là 11 V và ion tạo thành có m/z = 198.
c. Nghiên cứu điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao
Các đồng phân S-ATN và R-ATN, khi ion hóa ở nguồn ESI với chế độ điện tích dương đều tạo ra các ion ban đầu có số khối 267 Da nên không thể phân biệt được bằng phương pháp phổ khối lượng. Để phân tích đồng thời S-ATN và R-ATN bằng phương pháp LC-MS/MS cần phải nghiên cứu điều kiện sắc ký lỏng phù hợp để phân tách ĐPĐQ trước khi tiến hành phân tích phổ khối lượng.
Hai phương pháp HPLC phân tích ĐPĐQ của ATN đã xây dựng ở Mục 3.2.1 đều có thành phần pha động là các hợp chất dễ bay hơi và không có muối vô cơ nên có thể ghép nối được với thiết bị MS thông qua nguồn ion hóa ESI.
Tiến hành phân tích LC-MS/MS các mẫu chuẩn R,S-ATN hòa tan trong pha động sắc ký với hai phương pháp sắc ký xây dựng ở Mục 3.2.1.
Kết quả thực nghiệm cho thấy, cả hai phương pháp HPLC đều phân tách được các ĐPĐQ và ghép nối được với đầu dò MS thông qua nguồn ESI. Phương pháp phân tích trên cột Chirex 3022 có thời gian phân tích kéo dài (gần 20 phút); độ phân giải giữa các pic đồng phân không lớn (Rs = 2-3) và đặc biệt do tốc độ dòng dung môi pha động lớn nên cần phải cung cấp một lượng lớn khí nitrogen vào nguồn ESI để bay hơi dòng dung môi pha động. Vì vậy, quá trình ion hóa ATN ở nguồn ESI đạt hiệu suất không cao và ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp. Phương pháp phân tích trên cột Chiralpak CBH có thời gian phân tích ngắn (khoảng 7 phút); độ phân giải giữa các pic đồng phân lớn (Rs > 5). Đồng thời do tốc độ dòng dung môi pha động không lớn (0,7 ml/phút) nên quá trình ion hóa ATN ở nguồn ESI đạt hiệu quả cao và làm cho phương pháp có độ nhạy tốt hơn so với phương pháp phân tích trên cột Chirex 3022. Sắc ký đồ
phân tích mẫu chuẩn R,S-ATN bằng phương pháp LC-MS/MS với cột Chiralpak CBH được trình bày ở Hình 3.25.
RT:0.00 - 6.80
0 1 2 3 4 5 6
Time (min) 0
50 100 0 50 100
Relative Abundance
0 50 100
AA: 429059 SN: 3870
AA: 430463 SN: 1513
AA: 171243 SN: 11827
NL: 2.94E4 TIC MS S8
NL: 2.94E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]
MS Genesis S8
NL: 8.00E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 346.100 [197.750-198.250]
MS Genesis S8
Hình 3.25. SKĐ phân tích mẫu chuẩn atenolol và IS trên cột Chiralpak CBH Chú giải hình: (a): SKĐ tổng các ion (TIC – Total ion chromatogram)
(b): SKĐ chọn lọc ion atenolol (SRM, m/z: 267 190)
(c): SKĐ chọn lọc ion nội chuẩn esomeprazol (SRM, m/z: 346 198).
Từ các kết quả thực nghiệm, xác định được điều kiện sắc ký lỏng của phương pháp LC-MS/MS phân tích các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương như sau:
Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; 5 àm), ổn định ở 25 C, cú bảo vệ cột.
Pha động: 2-propanol – dung dịch đệm amoni acetat 10 mM điều chỉnh pH 5,9 bằng acid acetic, tỷ lệ 10 : 90 (v/v). Tốc độ dòng 0,7 ml/phút.
Thể tớch tiờm mẫu: 5 àl.
d. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương
Xử lý mẫu đóng vai trò quan trọng trong các phương pháp hóa lý phân tích thuốc trong dịch sinh học. Kỹ thuật xử lý mẫu là phù hợp khi hoạt chất cần phân tích được thu hồi với hiệu suất cao, lặp lại; quy trình xử lý mẫu đơn giản, an toàn, kinh tế đồng thời loại bỏ được ảnh hưởng của nền mẫu đối với phương pháp phân tích.
Dựa trên các đặc điểm hóa lý của ATN và đặc điểm sinh học của mẫu huyết tương (HT), tiến hành khảo sát xây dựng quy trình xử lý trên các mẫu HT trắng và mẫu HT
(a)
(b)
(c)
tự tạo chứa dược chất cần phân tích có nồng độ thích hợp và xử lý mẫu HT theo một trong hai phương pháp sau:
Phương pháp tủa protein
Hút 1,0 ml mẫu HT, thêm dung dịch nội chuẩn, lắc cho đồng nhất. Tủa protein với 0,25
0,5 ml một trong các acid: perchloric, trichloroacetic, trifluoroacetic hoặc 2 3 ml các dung môi hữu cơ như MeOH hay MeCN. Lắc xoáy, ly tâm tốc độ cao. Lấy dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 m và tiêm sắc ký.
Phương pháp chiết lỏng - lỏng
Chiết ATN trong HT bằng các hệ dung môi hữu cơ không đồng tan với nước khác nhau theo sơ đồ – Hình 3.26.
Hình 3.26. Sơ đồ nghiên cứu chiết ATN trong HT bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng Tiến hành phân tích LC-MS/MS các mẫu dịch thu được từ các quy trình xử lý theo các điều kiện phân tích đã nghiên cứu ở trên. Đánh giá khả năng phân tách các ĐPĐQ của ATN, sự ảnh hưởng của nền mẫu và độ thu hồi hoạt chất, nội chuẩn của mỗi quy trình xử lý mẫu bằng cách so sánh kết quả sắc ký với các mẫu chuẩn trong pha động phân tích đồng thời. Bố trí thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu tương tự như
Lắc chiết
Ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút - Acid hóa hoặc kiềm hóa
- 5 - 7 ml dung môi chiết* - Lắc cơ học, ly tâm
*Dung môi chiết:
1. Dichloromethan, chloroform, butanol, isopropanol, diethyl ether.
2. Chloroform (butanol, isopropanol) : diethyl ether tỷ lệ 3:7/ 4:6 (v/v)….
Lấy 3 - 5 ml lớp dung môi
Thu cắn
Hòa tan cắn.
Lọc 0,45 àm và tiờm sắc ký 0,5 – 1 ml pha động
Cô bay hơi dung môi N2, 40oC
1 ml mẫu huyết tương
quá trình tối ưu hóa điều kiện phổ khối. Dung dịch chuẩn và nội chuẩn trong pha động được bơm liên tục vào thiết bị MS qua infusion pump còn mẫu dịch thu được từ các quy trình xử lý mẫu HT sau khi chuyển lên cột sắc ký được pha động rửa giải và chuyển vào thiết bị MS qua bơm HPLC.
Kết quả nghiên cứu các phương pháp xử lý mẫu HT như sau:
Phương pháp tủa protein
Quy trình xử lý mẫu đơn giản, dễ áp dụng song cường độ tín hiệu thu được của mẫu chuẩn thấp, không ổn định và có sự suy giảm tín hiệu ở các lần sắc ký lặp lại. Điều này có thể do nền mẫu chưa được sạch, còn nhiều tạp chất có trong nền mẫu đồng rửa giải cùng với ATN, cản trở khả năng ion hóa ATN thành [ATN+H]+ ở nguồn ESI, làm cho độ lặp lại và độ nhạy của phương pháp không cao. Ảnh hưởng của nền mẫu lớn nhất, lên tới hơn 90% khi mẫu được tủa protein bằng MeCN – Hình 3.27.
RT:0.00 - 11.99
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time (min) 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Relative Abundance
10.52 11.21 10.47
10.37 10.28 1.30 1.98
1.14 2.02 9.94
9.72 9.53 2.17 9.34
9.24 2.28
2.36 9.15
2.55 2.84
3.41 3.87 4.57 5.37 6.07 6.41 7.24 8.04 9.05
NL:
4.09E5 TIC MS INFUSION- ME- TUAPROTE IN5
Hình 3.27. Sắc ký đồ dòng ion ATN và IS khi phân tích mẫu huyết tương trắng đã xử lý tủa protein bằng MeCN
Phương pháp chiết lỏng - lỏng
+ Trong số các dung môi, hỗn hợp dung môi không đồng tan với nước đã khảo sát: n- butanol; isopropanol; chloroform có độ thu hồi ATN và nội chuẩn cao hơn so với dichloromethan; diethyl ether và các hỗn hợp như diethyl ether – dichloromethan hay diethyl ether – chloroform (với các tỷ lệ 7 : 3; 6 : 4; 5 : 5 v/v).
+ n-butanol, isopropanol có độ thu hồi ATN và IS cao hơn so với chloroform, nhưng thời gian bay hơi dung môi lâu, không phù hợp khi phân tích một số lượng lớn mẫu.
+ Với các hệ dung môi chứa diethyl ether, tỷ lệ diethyl ether trong hỗn hợp càng lớn thì thời gian bay hơi dung môi thu cắn càng nhanh nhưng độ thu hồi hoạt chất giảm.
+ Cùng một hệ dung môi chiết, mẫu HT được kiềm hóa có độ thu hồi ATN và nội chuẩn cao hơn so với mẫu HT bị acid hóa hoặc không được kiềm hóa. Trong số các mẫu HT kiềm húa bằng dung dịch NH4OH 0,1M với thể tớch từ 100 đến 1000 àl, mẫu được kiềm húa bằng 500 àl dung dịch amoniac cú độ thu hồi ATN, nội chuẩn đạt giỏ trị cao và lặp lại.
+ Mẫu HT chiết bằng chloroform sau khi đã kiềm hóa với NH4OH 0,1M có tín hiệu đo của nền mẫu thấp, không gây hiện tượng ảnh hưởng nền mẫu (Hình 3.28). Do vậy, phương pháp chiết lỏng – lỏng với chloroform sau khi kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH 0,1M để xử lý các mẫu HT chứa ATN được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
RT:0.00 - 10.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Time (min) 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Relative Abundance
5.88 8.81 8.85
9.62 9.85 4.94 6.65
0.42 0.86 1.40 1.86 2.33 3.00 3.47 4.03 4.62 5.62 6.21 7.23 7.79 8.26
NL:
2.03E7 TIC MS ANHHUON GNEN25_1 408141353 18
Hình 3.28. Sắc ký đồ dòng ion ATN và IS khi phân tích mẫu huyết tương trắng đã xử lý chiết lỏng - lỏng với chloroform
e. Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng các ĐPĐQ của ATN trong HT Từ các kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng được phương pháp LC-MS/MS định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương người như sau:
Quy trình xử lý mẫu huyết tương:
1,0 ml HT, thờm 50 àl dung dịch IS và 500 àl NH4OH 0,1M. Lắc xoỏy, sau đú chiết với 5 ml chloroform. Lắc cơ học 15 phút, ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút. Lấy 3 ml lớp chloroform, cô bay hơi dung môi dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC đến cắn. Hòa cắn trong 1 ml pha động và tiêm sắc ký.
Điều kiện sắc ký:
- Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; 5 àm) ổn định ở 25 C, cú bảo vệ cột.
- Pha động: 2-PrOH – amoni acetat 10 mM (pH 5,9) tỷ lệ 10 : 90. Tốc độ 0,7 ml/phút.
- Thể tớch tiờm mẫu: 5 àl. Nhiệt độ autosampler (buồng tiờm mẫu): 4 oC.
Điều kiện khối phổ: Phổ khối Triple Quadrupole MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+).
Các thông số của thiết bị khối phổ để định lượng các ĐPĐQ của ATN và IS trong huyết tương được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.17.
Bảng 3.17. Điều kiện khối phổ định lượng atenolol và nội chuẩn Hoạt chất
Thông số R-ATN S-ATN Esomeprazol
Điện thế nguồn phun (Spray voltage) 3200 V 3200 V 3200 V Nhiệt độ nguồn phun (Spray temperature) 200 oC 200 oC 200 oC Áp suất khí mang (Sheath gas pressure) 40 psi 40 psi 40 psi Áp suất khí bổ trợ (Auxilary gas pressure) 5 psi 5 psi 5 psi Áp suất khí quét ion (Sweep gas pressure) 1 psi 1 psi 1 psi Nhiệt độ mao quản (Capillary temperature) 360 oC 360 oC 360 oC Ion ban đầu (Parent ion), m/z 267,0 267,0 346,1 Thế phân mảnh ion (Collision energy) 17 V 17 V 11 V Ion tạo thành (Product ion), m/z 190,0 190,0 198,0
Sắc ký đồ phân tích mẫu HT chứa chuẩn ATN racemic và IS bằng phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu xây dựng ở trên được trình bày ở Hình 3.29.
RT:0.00 - 7.99
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (min) 0
50 100 0 50 100
Relative Abundance 0 50
100 3.68 3.70
3.63
5.87 5.90 5.93
3.58 3.78 5.78
4.23 4.30 6.07
3.54
6.16 4.44 5.68
3.49 4.68 6.34 6.79 7.44
0.29 0.88 1.51 1.73 2.33 3.30
3.68
5.90
5.06 7.80
0.29 0.88 1.51 2.33 3.08
4.23
5.98 6.25 6.68 7.22 7.79 0.85
0.63 1.62 2.29 2.53 2.94 3.35
NL: 2.19E4 TIC MS S8
NL: 2.19E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]
MS S8
NL: 9.25E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 346.100 [197.750-198.250]
MS S8
Hình 3.29. Sắc ký đồ mẫu HT chứa R,S-ATN và IS phân tích bằng LC-MS/MS (a): SKĐ tổng ion, (b): SKĐ chọn lọc ion atenolol, (c): SKĐ chọn lọc ion esomeprazol.
(a)
(b)
(c)