Xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng atenolol toàn phần

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.2. PHÂN TÍCH ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN TRONG HUYẾT TƯƠNG

3.2.2. Nghiên cứu định lượng atenolol toàn phần trong huyết tương bằng LC-MS/MS

3.2.2.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng atenolol toàn phần

Về nguyên tắc, hàm lượng ATN toàn phần trong mỗi mẫu bằng tổng hàm lượng các đồng phân S-ATN và R-ATN có trong mẫu đó. Do vậy, phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời các ĐPĐQ của ATN trong HT đã xây dựng ở Mục 3.2.1 không những xác định được nồng độ của từng đồng phân đối quang ATN trong mẫu mà còn cho kết quả hàm lượng ATN toàn phần có trong mẫu HT. Tuy vậy, phương pháp phân tích đồng thời các ĐPĐQ khá khó khăn và phức tạp. Hơn nữa, không phải tất cả các trường hợp đều yêu cầu phân tích các ĐPĐQ của ATN. Nhiều trường hợp chỉ cần xác định hàm lượng ATN toàn phần trong mẫu là đủ. Do vậy, bên cạnh nghiên cứu, xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời các đồng phân đối quang S-ATN và R- ATN trong HT, luận án cũng trình bày kết quả nghiên cứu xây dựng phương pháp LC- MS/MS định lượng ATN toàn phần trong các mẫu HT.

Tiến hành khảo sát xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong huyết tương tương tự như khảo sát xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương (Mục 3.2.1). Các điều kiện phổ khối MS/MS của ATN được giữ nguyên, các nội dung khác như thông số kỹ thuật của nguồn ESI; chất nội chuẩn; điều kiện sắc ký… được thay đổi để phù hợp với phương pháp phân tích mới.

Từ các kết quả nghiên cứu khảo sát, đã xây dựng được phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong huyết tương như sau:

 Điều kiện sắc ký:

- Cột Nucleodur C18 (2,0 x 50 mm; 1,8 àm) ổn định ở 40 C, cú bảo vệ cột.

- Pha động: MeCN – dung dịch amoni acetat 2 mM tỷ lệ 70 : 30. Tốc độ 0,2 ml/phút.

- Thể tớch tiờm mẫu: 5 àl.

 Quy trình xử lý mẫu huyết tương:

1,0 ml HT, thờm 50 àl dung dịch IS và 500 àl NH4OH 0,1M. Lắc xoỏy, sau đú chiết với 5 ml chloroform. Lắc cơ học 15 phút, ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút.

Lấy 3 ml lớp chloroform, cô bay hơi dung môi dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC đến cắn. Hòa cắn trong 1 ml pha động và tiêm sắc ký.

 Điều kiện khối phổ:

Phổ khối Triple Quadrupole MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+). Các thông số của thiết bị khối phổ để định lượng các ĐPĐQ của ATN và IS trong huyết tương được

trình bày tóm tắt ở Bảng 3.31.

Bảng 3.31. Điều kiện khối phổ định lượng atenolol và nội chuẩn diltiazem Hoạt chất

Thông số Atenolol Diltiazem (IS)

Điện thế nguồn phun (Spray voltage) 3200 V 3200V

Nhiệt độ nguồn phun (Spray temperature) 50 oC 50 oC Áp suất khí mang (Sheath gas pressure) 20 psi 20 psi

Áp suất khí bổ trợ (Auxilary gas pressure) 5 psi 5 psi Áp suất khí quét ion (Sweep gas pressure) 1 psi 1 psi

Nhiệt độ mao quản (Capillary temperature) 360 oC 360 oC

Ion ban đầu (Parent ion), m/z 267,0 415,1

Thế phân mảnh ion (Collision energy) 17 V 22 V

Ion tạo thành (Product ion), m/z 190,0 178,1

Sắc ký đồ mẫu HT chứa chuẩn ATN và IS phân tích bằng phương pháp LC- MS/MS đã nghiên cứu xây dựng ở trên được trình bày ở Hình 3.31.

RT:0.00 - 3.19

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Time (min) 0

20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Relative Abundance

0 20 40 60 80

100 1.38 1.40 1.43

1.35 1.48 1.31 1.52

1.29 1.55 1.88 1.92 1.26 2.00

2.11 2.33 2.67

0.62 2.94

0.23 0.74

RT: 1.40

RT: 1.88

NL: 1.00E5 TIC MS C8

NL: 1.00E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750- 190.250] MS Genesis C8

NL: 3.50E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 415.100 [177.850- 178.350] MS Genesis C8

Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa R,S-ATN và IS phân tích bằng LC-MS/MS (a): SKĐ tổng ion, (b): SKĐ chọn lọc ion atenolol, (c): SKĐ chọn lọc ion diltiazem.

(a)

(b)

(c)

3.2.2.2. Thầm định phương pháp LC-MS/MS định lượng atenolol toàn phần

Tiến hành thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong huyết tương theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của EMA [68], FDA – Mỹ [184] và tương tự như thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương (Mục 3.2.2).

Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT đáp ứng các yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. Kết quả thẩm định trình bày tóm tắt như dưới đây.

a. Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần Phân tích các mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa chuẩn ATN với nồng độ khoảng 5 ng/ml (bằng khoảng 1/60 Cmax khi uống liều đơn 50 mg ATN) có chứa nội chuẩn DIL theo phương pháp đã được xây dựng.

Trên SKĐ mẫu HT trắng (Hình 3.32a) tại các thời điểm 1,4 và 1,8 phút (trùng với tR của ATN và nội chuẩn diltiazem (DIL) trong mẫu chuẩn – Hình 3.32b), không xuất hiện các pic có các mảnh phổ m/z = 267190 (ATN) và m/z = 415178 (DIL).

RT :0.00 - 2.85

0 1 2

T i me (mi n) 0

20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Relative Abundance

0 20 40 60 80

100 0.12 0.28

0.72 1.89 2.81

0.18

1.35

0.72 1.66

1.98 2.82

0.12 0.28

0.72 1.89

2.81 NL: 1.82E2 TIC M S B L3

NL: 1.22E2 TIC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]

M S B L3

NL: 1.82E2 TIC F: + c ESI SRM ms2 268.100 [115.950-116.450]

M S B L3

RT :0.00 - 4.00

0 1 2 3

T ime (min) 0

50 100 0 50 100

Relative Abundance

0 50 100

RT : 1.38 AA: 11141 SN: 155

RT : 1.85 AA: 1170771 SN: 1379

NL: 8.36E4 T IC MS S1

NL: 8.35E2 T IC F: + c ESI SRM ms2 267.000 [189.750-190.250]

MS Genesi s S1

NL: 8.36E4 T IC F: + c ESI SRM ms2 415.100 [177.850-178.350]

MS ICIS S1

a. Mẫu HT trắng b. Mẫu HT chứa chuẩn ATN (5 ng/ml) và nội chuẩn diltiazem (DIL)

Hình 3.32. Độ đặc hiệu–chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần Chú giải hình: Trên: Sắc ký đồ tổng ion (Total Ion Chromatograms – TIC)

Giữa: Sắc ký đồ chọn lọc ion của ATN (SRM, m/z: 267  190) Dưới: Sắc ký đồ chọn lọc ion của DIL (SRM, m/z: 415  178).

Kết quả phân tích cũng cho thấy, đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của ATN (1,4 phút) nhỏ hơn 2% đáp ứng của pic ATN ở nồng độ 5 ng/ml và đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của DIL (1,8 phút) không vượt quá 1% đáp ứng của DIL. Do vậy, phương pháp đặc hiệu và chọn lọc đối với ATN.

b. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành pha các mẫu HT chứa chuẩn ATN có nồng độ khoảng từ 5 đến 1000 ng/ml.

Phân tích theo quy trình đã xây dựng. Xác định sự tương quan giữa nồng độ ATN (x) có trong mẫu và tỷ lệ diện tích pic ATN/DIL (y) bằng phương pháp hồi quy tuyến tính, sử dụng hệ số tỷ trọng (1/nồng độ2).

Kết quả xác định mối tương quan tuyến tính được trình bày trong Bảng 3.32.

Bảng 3.32. Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong huyết tương

Mẫu chuẩn

Nồng độ (ng/ml)

Đường chuẩn 1

Đường chuẩn 2

Đường chuẩn 3

Đường chuẩn 4

Đường chuẩn 5 Tỷ lệ

ATN/

DIL Độ đúng

(%)

Tỷ lệ ATN/

DIL Độ đúng

(%)

Tỷ lệ ATN/

DIL Độ đúng

(%)

Tỷ lệ ATN/

DIL Độ đúng

(%)

Tỷ lệ ATN/

DIL Độ đúng

(%) C1 5,2 0,012 99,4 0,012 106,4 0,013 105,0 0,014 98,3 0,014 100,2 C2 10,4 0,023 97,6 0,020 91,8 0,022 93,4 0,025 99,0 0,025 96,5 C3 20,7 0,048 104,9 0,039 92,1 0,041 93,1 0,053 108,5 0,052 105,8 C4 51,8 0,118 105,2 0,099 97,1 0,108 100,6 0,119 100,7 0,121 100,1 C5 103,6 0,226 101,2 0,193 95,4 0,207 97,6 0,235 100,6 0,240 100,7 C6 310,7 0,680 101,7 0,612 101,6 0,650 102,8 0,708 101,7 0,738 103,9 C7 621,4 1,322 98,9 1,316 109,5 1,338 106,1 1,380 99,3 1,429 100,8 C8 1035,6 2,029 91,1 2,124 106,0 2,129 101,4 2,131 92,0 2,173 92,0

Phương trình hồi quy

(y = ax + b)

a = 0,0022 a = 0,0019 a = 0,0020 a = 0,0022 a = 0,0023 b = 0,0008 b = 0,0018 b = 0,0022 b = 0,0023 b = 0,0025 r = 0,9986 r = 0,9969 r = 0,9984 r = 0,9986 r = 0,9988 Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng độ từ 5 ng/ml đến 1000 ng/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ ATN và tỷ lệ diện tích pic ATN/DIL với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1. Nồng độ ATN xác định từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết đều đạt xấp xỉ 100% và nằm trong giới hạn cho phép theo qui định của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

c. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Phân tích LC-MS/MS các lô mẫu huyết tương LLOQ, LQC, MQC và HQC chứa ATN với nồng độ tương ứng là 5, 15, 400 và 800 ng/ml. Xác định nồng độ ATN có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn. Kết quả trình bày ở Bảng 3.33.

Bảng 3.33. Độ chính xác của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần

Ngày

Mẫu LLOQ Mẫu LQC Mẫu MQC Mẫu HQC Nồng

độa (ng/ml)

Độ đúngb

(%)

Nồng độa (ng/ml)

Độ đúngb

(%)

Nồng độa (ng/ml)

Độ đúngb

(%)

Nồng độa (ng/ml)

Độ đúngb

(%)

1

1 4,3 82,4 13,6 90,0 391,1 96,8 832,3 102,9

2 4,5 86,5 13,8 90,9 394,2 97,5 826,2 102,2

3 4,6 90,1 15,0 99,2 410,7 101,6 792,4 98,0

4 4,5 88,1 14,9 98,1 418,6 103,6 784,8 97,1

5 5,1 98,4 14,5 95,8 384,7 95,2 810,5 100,2

6 4,4 85,8 14,0 92,6 362,9 89,8 799,7 98,9

2

1 4,2 81,4 13,8 88,2 404,6 97,2 827,7 99,4

2 4,3 83,3 15,1 96,6 419,8 100,8 856,4 102,9

3 4,4 84,2 15,0 95,8 428,1 102,8 840,8 101,0

4 4,8 92,3 14,4 92,2 474,4 114,0 763,0 91,6

5 4,9 95,0 14,1 90,6 404,3 97,1 820,4 98,5

6 4,5 86,1 13,6 87,1 414,4 99,6 829,5 99,6

3

1 6,0 112,6 14,8 95,5 409,6 99,3 878,3 106,5

2 4,8 91,1 13,2 85,1 435,2 105,6 795,7 96,5

3 4,9 93,0 17,2 111,1 426,3 103,4 736,5 89,3

4 6,3 118,6 14,7 95,1 373,9 90,7 845,8 102,6

5 5,7 107,5 14,1 91,1 402,5 97,6 807,4 97,9

6 6,0 113,9 16,7 108,3 378,4 91,8 740,2 89,8

4

1 4,3 82,0 14,7 100,1 428,5 109,8 836,0 107,1 2 4,9 94,7 15,2 103,7 387,6 99,3 828,9 106,2

3 5,7 110,3 12,4 85,0 380,7 97,6 835,2 107,0

4 4,9 93,4 13,4 91,9 360,5 92,4 863,5 110,6

5 4,9 95,0 13,0 88,9 398,6 102,1 863,5 110,6

6 4,8 91,8 12,5 85,5 371,6 95,2 760,6 97,5

5

1 6,6 118,1 15,5 104,2 403,7 101,9 851,9 107,5

2 4,7 84,0 16,3 109,8 387,6 97,8 866,5 109,3

3 5,9 106,7 13,5 91,0 366,2 92,4 854,5 107,8

4 5,0 89,4 14,3 96,4 365,5 92,2 894,9 112,9

5 5,2 94,4 14,0 94,3 393,5 99,3 909,6 114,8

6 4,8 86,4 13,2 88,8 404,3 102,0 787,2 99,3

Trung bình 94,6 94,8 98,9 102,2

CV (%) 11,8 7,5 5,5 6,3

(a) Xác định từ phương trình hồi quy (b) % so với nồng độ thực

Kết quả thẩm định cho thấy ở cả ba khoảng nồng độ thấp, trung bình và cao, phương pháp có độ đúng trong ngày, khác ngày nằm trong khoảng 85,0% - 114,8%

(đều nằm trong khoảng cho phép 85% - 115%), độ chính xác trong ngày, khác ngày với giá trị CV dao động từ 2,3% - 7,5% (nhỏ hơn 15%); riêng mẫu LLOQ có độ đúng trong khoảng 81,4% - 118,6% (đều nằm trong khoảng cho phép 80% - 120%), độ chính xác trong ngày, khác ngày với giá trị CV lần lượt là 6,2% và 11,8% (nhỏ hơn 20%). Như vậy phương pháp đã xây dựng đạt yêu về độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày theo hướng dẫn của FDA-Mỹ và EMA.

d. Giới hạn định lượng dưới của phương pháp

Phân tích các mẫu HT trắng và mẫu HT chứa ATN nồng độ 5 ng/ml (mẫu LLOQ).

Xác định diện tích pic ATN và DIL của các mẫu LLOQ và xác định nồng độ ATN có trong các mẫu từ đường chuẩn tiến hành làm song song trong cùng điều kiện.

Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT được trình bày ở Bảng 3.34.

Bảng 3.34. LLOQ của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần Stt Tỷ lệ diện tích

pic ATN/DIL

Nồng độ xác định từ đường chuẩn (ng/ml)

Độ đúng so với nồng độ thực (%)

Giá trị S/N của pic ATN

1 9,92 x 10-3 4,2 95,0 S/N > 10

2 1,01 x 10-2 4,3 83,3 S/N > 10

3 1,02 x 10-2 4,4 84,2 S/N > 10

4 1,11 x 10-2 4,8 92,3 S/N > 10

5 1,14 x 10-2 4,9 81,4 S/N > 10

6 1,04 x 10-2 4,5 86,1 S/N > 10

Trung bình (%) 87,1

CV (%) 6,2

Các mẫu LLOQ có giá trị S/N > 10, nồng độ ATN xác định từ đường chuẩn so với nồng độ thực có trong mẫu nằm trong khoảng từ 80 – 120%, CV < 20% đáp ứng yêu cầu giới hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

e. Ảnh hưởng của nền mẫu

Phân tích các mẫu chuẩn ATN pha trong nền mẫu và pha trong pha động. Xác định giá trị MF của ATN, IS và tỷ số MFATN/MFIS.

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu được trình bày ở Bảng 3.35.

Bảng 3.35. Ảnh hưởng nền mẫu trong phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần Số thứ tự MFATN MFIS MFATN/MFIS

LQC HQC LQC HQC LQC HQC

1 0,91 1,01 0,97 1,03 0,940 0,978

2 0,90 1,00 0,97 0,98 0,931 1,023

3 0,87 1,01 0,97 1,03 0,898 0,983

4 0,93 0,99 1,01 1,00 0,928 0,987

5 0,95 1,01 0,98 0,98 0,967 1,033

6 0,94 0,99 0,97 0,99 0,967 1,002

Trung bình 0,92 1,00 0,98 1,00 0,938 1,001

CV (%) 3,1 1,0 1,6 2,4 2,8 2,3

Kết quả ở Bảng 3.35 cho thấy, tỷ số MFATN/MFIS ở cả hai mức nồng độ thấp và cao có giá trị CV nhỏ hơn 5%, đáp ứng yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. Như vậy, quy trình xử lý mẫu HT chiết lỏng – lỏng với chloroform không gây ảnh hưởng của nền mẫu đối với phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT.

f. Độ thu hồi nội chuẩn diltiazem của quy trình xử lý mẫu

Tiến hành xác định độ thu hồi nội chuẩn diltiazem của quy trình xử lý mẫu HT tương tự như xác định độ thu hồi hoạt chất và nội chuẩn của phương pháp LC-MS/MS định lượng các ĐPĐQ của ATN trong huyết tương (Mục 3.2.1.2g).

Kết quả xác định độ thu hồi nội chuẩn diltiazem được trình bày ở Bảng 3.36.

Bảng 3.36. Độ thu hồi nội chuẩn diltiazem của phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần

STT Diện tích pic nội chuẩn

Mẫu huyết tương Mẫu trong pha động

1 763529 1688596

2 771182 1699317

3 738572 1694883

4 772741 1714329

5 755028 1598440

Trung bình 760211 1679113

CV (%) 1,8 2,7

Độ thu hồi* (%) 75,5

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng.

Kết quả thẩm định cho thấy, quy trình xử lý mẫu HT chiết lỏng – lỏng với chloroform có độ thu hồi nội chuẩn diltiazem xấp xỉ 76%.