CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Nghiên cứu định lượng ATN và ĐPĐQ trong huyết tương bằng LC-MS/MS
2.3.2.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS
Sau quá trình khảo sát xây dựng phương pháp, lựa chọn được phương pháp phân tích ATN gồm điều kiện sắc ký và qui trình xử lý mẫu thích hợp để tiến hành thẩm định phương pháp theo qui định của US-FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích
trong dịch sinh học. Các chỉ tiêu cần thẩm định bao gồm: Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp; ảnh hưởng của nền mẫu; giới hạn định lượng dưới của phương pháp;
đường chuẩn–khoảng tuyến tính; độ nhiễm chéo giữa các lần phân tích; độ đúng – độ chụm trong ngày, khác ngày; độ thu hồi hoạt chất và độ ổn định của hoạt chất trong quá trình xử lý, phân tích và bảo quản mẫu dài ngày [68], [184].
Tiến hành thẩm định trên các mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa chuẩn ATN (racemic hoặc các ĐPĐQ) có nồng độ phù hợp. Các mẫu HT tự tạo (CC và QC) chứa ATN được chuẩn bị như sau:
- Mẫu chuẩn CC: Hòa tan 40 mg chuẩn ATN trong bình định mức 100ml và 10 mg chuẩn R-ATN hoặc S-ATN trong các bình định mức 50ml với MeOH để thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ chính xác khoảng 400 g/ml (với ATN) hoặc 200
g/ml (với R- và S-ATN). Pha loãng các dung dịch chuẩn gốc với MeOH vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ chính xác khoảng 10 g/ml (với ATN) hoặc 5 g/ml (với R- và S-ATN). Hút chính xác 1 thể tích xác định dung dịch chuẩn làm việc, cô bay hơi hoàn toàn dung môi dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC, thu cắn. Hòa tan cắn với HT trắng vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc 1 (CLV1) có nồng độ ATN trong HT là 1000 ng/ml (với ATN) hoặc 500 ng/ml (với R- và S-ATN). Tiếp tục pha loãng các dung dịch CLV1 với HT trắng để thu được dung dịch chuẩn làm việc 2 (CLV2) có nồng độ 100 ng/ml (với ATN) hoặc 50 ng/ml (với R- và S-ATN). Từ các dung dịch CLV1 và CLV2, tiếp tục pha loãng với HT trắng để được các mẫu chuẩn CC có nồng độ ATN từ 5,0 đến 1000 ng/ml; R-ATN hoặc S-ATN có nồng độ từ 2,5 đến 500 ng/ml – Bảng 2.1.
Bảng 2.1- Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn ATN trong huyết tương
Mẫu chuẩn C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
Thể tớch HT trắng (àl) 950 900 800 500 0 700 400 0 Thể tớch CLV1 (àl) - - - 300 600 1000
Thể tớch CLV2 (àl) 50 100 200 500 1000 - - -
- Mẫu kiểm tra QC: Chuẩn bị các mẫu kiểm tra QC một cách độc lập với mẫu chuẩn CC. Tiến hành tương tự như mẫu chuẩn CC để được các mẫu kiểm tra LQC, MQC, và HQC chứa chuẩn ATN hoặc chuẩn R-ATN hoặc chuẩn S-ATN trong HT trắng. Các mẫu LQC có nồng độ dược chất bằng khoảng 3 lần nồng độ dược chất trong mẫu C1 – mẫu thấp nhất của đường chuẩn (khoảng 15 ng/ml đối với ATN hoặc 7,5 ng/ml với
chuẩn R- hoặc S-ATN). Các mẫu MQC có nồng độ dược chất bằng khoảng 40 - 60%
nồng độ dược chất trong mẫu C8 – mẫu cao nhất của đường chuẩn (khoảng 400 ng/ml đối với ATN hoặc 200 ng/ml với chuẩn R- hoặc S-ATN). Các mẫu HQC có nồng độ dược chất bằng khoảng 75 – 90% nồng độ dược chất trong mẫu C8 (khoảng 800 ng/ml đối với ATN hoặc 400 ng/ml với chuẩn R-ATN hoặc S-ATN).
2.3.2.3. Phân tích atenolol và đồng phân trong huyết tương người bằng LC-MS/MS a. Phân tích atenolol và đồng phân trong các mẫu huyết tương của bệnh nhân
Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS xác định nồng độ ATN và các ĐPĐQ trong HT một số bệnh nhân điều trị các bệnh tim mạch, huyết áp mà phác đồ điều trị có sử dụng các chế phẩm thuốc ATN. Khảo sát trên khoảng 6 – 10 bệnh nhân, các bệnh nhân được lấy các mẫu máu từ tĩnh mạch khuỷu tay vào thời điểm trước và sau khi sử dụng thuốc ATN khoảng 2 giờ. Các bệnh nhân có thể chỉ sử dụng thuốc ATN hoặc sử dụng ATN phối hợp với các thuốc khác tùy theo phác đồ điều trị do bác sỹ chỉ định. Mỗi lần lấy khoảng 5 ml. Các mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm chứa chất chống đông Na-EDTA, lắc nhẹ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút x 10 phút, tách lấy phần huyết tương và bảo quản lạnh ở nhiệt độ -35 ± 5 oC cho đến khi được phân tích.
Tiến hành phân tích xác định nồng độ ATN và ĐPĐQ trong mẫu HT bằng phương pháp LC-MS/MS đã được thẩm định. Từ kết quả khảo sát, đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp phân tích trong thực hành lâm sàng, nghiên cứu DĐH, hay nghiên cứu tương tác giữa ATN và các thuốc phối hợp...
b. Phân tích atenolol và đồng phân trong huyết tương người tình nguyện
Áp dụng phương pháp LC-MS/MS xác định nồng độ ATN và đồng phân trong HT NTN tham gia nghiên cứu khảo sát SKD một số chế phẩm thuốc ATN đang lưu hành trên thị trường. NTN là nam hoặc nữ giới khỏe mạnh, tuổi 18 – 40, có chỉ số BMI về cân nặng và chiều cao phải trong khoảng từ 18 – 25 kg/m2, được kiểm tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh, các xét nghiệm cơ bản và chấp thuận tự nguyện tham gia nghiên cứu sau khi đã được phổ biến đầy đủ và hiểu được nội dung nghiên cứu. Đề cương Nghiên cứu sinh khả dụng của một số chế phẩm chứa atenolol dạng racemic và dạng đơn đồng phân đối quang (S-Atenolol) được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học phê duyệt trước khi triển khai theo quy định. NTN sẽ uống liều đơn 50 mg ATN racemic hoặc 25 mg S-ATN theo bảng ngẫu nhiên với 240 ml nước sau khi nhịn ăn qua đêm ít nhất 10 giờ. Các thuốc dùng trong nghiên cứu gồm: Atenolol STADA® 50mg (viên nén ATN 50 mg – Công ty TNHH liên danh STADA Việt Nam); viên nén
S-Atenolol 25mg (Công ty Ahn-gook Pharm, Hàn Quốc); AtpureTM - 25 (viên nén S- ATN 25 mg – Công ty Emcure® Pharmaceuticals Ltd., Ấn Độ) và Tenormin tablets 50mg (viên nén ATN 50 mg – Công ty AstraZeneca UK Limited, Anh), trong đó thuốc Tenormin là thuốc đối chứng.
Lấy máu từ tĩnh mạch cẳng tay NTN ở các thời điểm: ngay trước khi uống thuốc (thời điểm 0 giờ) và sau khi uống thuốc 1; 1,5; 1,75; 2; 2,25; 2,5; 2,75; 3; 4; 6; 8; 12;
24 giờ. Mỗi thời điểm lấy khoảng 5 ml máu. Các mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm chứa chất chống đông Na-EDTA, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút x 10 phút, tách lấy phần HT và bảo quản lạnh ở nhiệt độ -35 ± 5 oC cho đến khi được phân tích. Kết thúc quá trình lấy mẫu, tiến hành phân tích xác định nồng độ ATN và các ĐPĐQ trong các mẫu.
Từ kết quả định lượng, xác định các thông số Cmax, Tmax, AUC0-t, AUC0-∞ của từng thuốc đối với mỗi NTN.
Trong đó: + Cmax, Tmax xác định trực tiếp từ số liệu thực nghiệm thu được.
+ AUC0-t tính theo nguyên tắc hình thang, bằng công thức:
1
n 0 i
i 1 i 1 i t i
0 2
) t t ( C AUC C
với Ci, Ci+1 là nồng độ dược chất trong huyết tương ở thời điểm ti và ti+1; n là thời điểm lấy mẫu cuối cùng mà nồng độ còn định lượng được.
+ AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λZ với Cn là nồng độ dược chất tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn định lượng được và λz là hệ số thải trừ.
+ Hệ số λz là độ dốc của đường bán logarit nồng độ thuốc theo thời gian của các điểm trong pha thải trừ.
So sánh, xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ số các thông số DĐH giữa các thuốc ATN racemic (Atenolol Stada với Tenormin); khoảng tin cậy 90% của tỷ số các thông số DĐH giữa các thuốc S-ATN (viên S-atenolol 25 mg với AtpureTM – 25) và khoảng tin cậy 90% của tỷ số các thông số DĐH giữa các thuốc S-ATN với các thông số DĐH của đồng phân S-ATN trong thuốc ATN racemic. Khoảng tin cậy 90% được xác định bằng phương pháp phân tích hai t-test một phía (two one-side t-test) và phân tích phương sai (ANOVA) bốn yếu tố: trình tự thử thuốc, NTN, giai đoạn thử thuốc và chế phẩm thuốc.
Từ kết quả so sánh SKD, đánh giá chất lượng các thuốc đang lưu hành cũng như đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp phân tích các ĐPĐQ.