1.1. ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.1.2. Phương pháp phân tích đồng phân đối quang
1.1.2.3. Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang thường gặp
Sắc ký khí (GC) là phương pháp tách dựa trên hai quá trình hấp phụ, giải hấp phụ xảy ra liên tục giữa pha tĩnh (thể rắn hoặc lỏng) và pha động ở thể khí. Cơ sở để tách bằng GC là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn và pha động là dòng khí chuyển dịch qua toàn bề mặt pha tĩnh. Nếu pha tĩnh ở thể rắn thì gọi là sắc kí khí-rắn và chất rắn nhồi cột thường là silicagel, than hoạt tính, một số polyme hoặc chất vô cơ có khả năng hấp phụ cao. Nếu pha tĩnh ở thể lỏng, ta có sắc kí khí- lỏng. Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt một chất rắn trơ tạo nên một lớp phim mỏng.
Cơ sở cho sự tách chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng này. Do khả năng hòa tan các chất của chất khí rất kém nên dòng khí (pha động) trong GC không đóng vai trò của một pha động thực sự trong hệ sắc ký mà chỉ làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi di chuyển dọc theo pha tĩnh để chúng có thể tương tác với các lớp pha tĩnh khác nhau. Đóng vai trò đẩy các chất ra khỏi pha tĩnh chính là nhiệt độ. Các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ bị lưu giữ bởi pha tĩnh hay bị lôi cuốn bởi dòng khí mang khác nhau, từ đó các chất sẽ tách khỏi nhau và được phát hiện ở bộ phận thu nhận tín hiệu [3], [17], [19], [86].
Phương pháp GC thường được áp dụng để phân tích các chất dễ bay hơi và không bị phân hủy bởi nhiệt độ. Trong phương pháp GC, các ĐPĐQ có thể được phân tách trực tiếp bằng pha tĩnh đặc hiệu (cột mao quản chứa pha tĩnh liên kết với tác nhân chọn lọc đối quang thích hợp) hoặc gián tiếp bằng cách phản ứng với các thuốc thử tạo các dẫn chất phi đối quang có các đặc điểm khác biệt nhau và có thể phân tách trên cột mao quản chứa pha tĩnh thông thường (không liên kết với tác nhân chọn lọc đối quang). Các thuốc thử như N-trifluoroacetyl-L-prolyl chlorid [135], (–)-α-Methoxy-α- trifluoromethylphenylacetic acid [120] hay (S)-(–)-N-(Trifluoroacetyl)-prolylchlorid [144] thường được sử dụng để tạo các dẫn chất trong phương pháp gián tiếp.
So với phương pháp gián tiếp, phương pháp GC trực tiếp phân tách các ĐPĐQ bằng cột mao quản chứa pha tĩnh đối quang được sử dụng rộng rãi hơn, do có độ đặc hiệu-chọn lọc, độ lặp lại tốt hơn. Pha tĩnh đối quang của cột GC thường là một trong các loại sau [77], [78], [109]:
- Phức hợp của các dẫn chất CD: Đây là nhóm cột GC được dùng phổ biến nhất để tách các ĐPĐQ, hiện có gần 50 loại cột chứa pha tĩnh thuộc nhóm này được ứng dụng để phân tích các ĐPĐQ [101], [196]. Cấu tạo một số pha tĩnh đối quang dẫn chất CD của một số cột GC được trình bày ở Hình 1.11 [196].
Hình 1.11. Cấu tạo một số pha tĩnh đối quang dẫn chất cyclodextrin của cột GC - Dẫn chất của các amino acid đối quang thông qua các liên kết hydro như N- propionyl-L-valin-tert-butylamid [124] hay S(−)-t-leucin-S(−)-1-phenylethylamid [96]… Cột GC có pha tĩnh đối quang thuộc nhóm này được thương mại hóa đầu tiên và có nhiều ứng dụng là Chirasil-val. Pha tĩnh của cột Chirasil-val có bản chất là phức hợp (L)-valin tert-butyl amid liên kết đồng hóa trị với polymer polysiloxan [53].
Một số ứng dụng phân tích ĐPĐQ trong dịch sinh học bằng phương pháp GC sử
- 19 -
dụng cột mao quản có pha tĩnh hoạt quang được trình bày ở Bảng 1.3.
Bảng 1.3. Một số phương pháp GC với pha tĩnh đặc hiệu phân tích ĐPĐQ
Hoạt chất Loại mẫu Pha tĩnh đối quang Đầu dò* TLTK Amino acid Nước tiểu N-propionyl-L-valin-tert-
butylamid polydimethylsiloxan
MS [124]
Fluoxetin, norfluoxetin
Huyết tương Nước tiểu
Heptakis-(2,3-di-O-methyl-6-O- tert-butyldimethyl-silyl)-β-CD
MS [99]
Ibuprofen Huyết tương Dimethyl (2,3-di-O-methyl-6- tert -butyl silyl)-β-CD
ESI-MS [76]
Mandelic acid Nước tiểu 2,3,6-tri-O-pentyl-β-CD ECD, FID [161]
Metamphetamin và tiền chất
Nước tiểu 2,6-di-O-pentyl-3-propionyl-γ-CD ESI-MS [157]
Warfarin Huyết tương S(-)-t-leucin-S(-)-1-phenyl- ethylamid polydimethylsiloxan
MS [96]
(*) Đầu dò ECD: cộng kết điện tử; FID: ion hóa ngọn lửa.
Ngoài hai loại cột mao quản có pha tĩnh liên kết với các tác nhân chọn lọc hoạt quang thuộc hai nhóm chính nói trên, trong thực tế còn sử dụng các cột mao quản có pha tĩnh là hỗn hợp các tác nhân hoạt quang để tăng cường khả năng tách ĐPĐQ của pha tĩnh [3], [51], [121], [177], [196].
b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất cần phân tích với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau, bao gồm pha tĩnh (cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải). Pha tĩnh (chất rắn hoặc chất lỏng) hấp phụ chất cần phân tích, lưu giữ lại trên cột, còn pha động (gồm một chất hoặc hỗn hợp nhiều chất lỏng) lại hòa tan, đẩy chất phân tích di chuyển ra khỏi cột sắc ký. Các chất cần phân tích khác nhau, sẽ có sự tương tác khác nhau đối với cả pha tĩnh và pha động, do vậy chúng di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ tách nhau khi ra khỏi cột sắc ký [3], [51], [122], [159].
So với phương pháp GC, phương pháp phân tích đồng phân đối quang bằng HPLC phổ biến hơn. Phương pháp HPLC có thể tách được các hợp chất không bay hơi hay các hợp chất ít bền với nhiệt hay các chất phân cực, ít phân cực hoặc không phân cực.
Hiện nay phân tích ĐPĐQ bằng phương pháp HPLC có thể tiến hành trực tiếp bằng
cách tạo ra các phức hợp phi đối quang tạm thời giữa chất cần phân tích và tác nhân chọn lọc hoạt quang ngay trong hệ sắc ký (sử dụng pha tĩnh đối quang hoặc pha động có tác nhân chọn lọc hoạt quang để tạo phức) hoặc bằng cách gián tiếp tạo các phức hợp không đối quang giữa chất phân tích với thuốc thử ngoài hệ sắc ký [24], [32], [77], [78], [164].
- Phương pháp phân tách gián tiếp: Hỗn hợp ĐPĐQ cần phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử tạo thành một hỗn hợp hai đồng phân không hoạt quang. Hỗn hợp tạo thành được tách bởi phương pháp HPLC pha thuận hoặc pha đảo thông thường. Một số thuốc thử được ứng dụng trong phân tích ĐPĐQ bằng phương pháp HPLC được trình bày tóm tắt ở Bảng 1.4 [82], [164].
Bảng 1.4. Một số thuốc thử được sử dụng trong phân tích ĐPĐQ bằng phương pháp HPLC
Thuốc thử Nhóm chức phản ứng
Kiểu sắc ký*
Ứng dụng phân tích [Tài liệu tham khảo]
Nhóm isothiocyanat (ISTCN):
+ 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl-ISTCN + R-α-methylbenzyl-ISTCN + 2,3,4-tri-O-acetyl-α-D- -arabinopyranosyl-ISTCN
Amin RP RP RP
Amino alcol, chẹn β-giao cảm, catecholamin [111], [114], [206]
Propranolol, ephedrin [165]
Amphetamin [133]
Nhóm isocyanat (ICN):
+ S(-)-1-phenylethyl-ICN + R(-)-1-(naphtyl)ethyl-ICN
Amin RP RP
Metoprolol [143]
Oxprenolol [116]
Nhóm anhydrid:
+ t-BOC-L-ala-anhydrid + t-BOC-L-leu-anhydrid
Hydroxyl RP RP
Propranolol [82]
Alprenolol [82]
Nhóm amin:
+ d,l-1-(1-anthryl)ethylamin Carboxylic NP Naproxen [82]
Nhóm acid:
+ α-methyl-1-naphtalen acetic Amin NP Dopamin, amino acid [82]
(*) RP: Sắc ký pha đảo; NP: Sắc ký pha thuận.
Phản ứng hóa học giữa dược chất cần phân tích và thuốc thử để hình thành hỗn hợp không đối quang phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khả năng/ hiệu suất phản ứng giữa các nhóm chức; mức độ tinh khiết của thuốc thử; nồng độ/ tỷ lệ nồng độ giữa
- 21 -
thuốc thử so với dược chất… Việc tìm ra thuốc thử phù hợp để phản ứng tạo dẫn chất không đối quang với chất cần phân tích còn gặp nhiều khó khăn và độ tin cậy của phương pháp bị ảnh hưởng bởi độ lặp lại của phản ứng tạo dẫn chất, cho nên phương pháp HPLC phân tách ĐPĐQ gián tiếp ít được sử dụng trong thực tế [82], [115].
- Phương pháp trực tiếp thêm đồng phân đối quang vào pha động: ĐPĐQ tinh khiết được thêm liên tục vào pha động HPLC để tạo thành các phức hợp không đối quang tạm thời giữa chất phân tích và pha động. Phức hợp tạo thành, có thể được tách bằng HPLC pha thuận hoặc pha đảo thông thường. Các chất thường được sử dụng để cho thêm vào pha động trong kỹ thuật này bao gồm các CD và dẫn chất [32], [87], [102], [125], [196]; phức hợp của một số kim loại hóa trị II (đồng, niken…) với một số acid amin như Cu(II)-L-phenylalanin… [100], [170] hoặc một số protein như BSA hay AGP [63], [87], [125].
Kĩ thuật thêm tác nhân chọn lọc hoạt quang vào pha động để phân tách ĐPĐQ không đòi hỏi các cột sắc ký đắt tiền nhưng có một số nhược điểm như: khả năng phân tách kém, độ phân giải giữa các pic không cao, hệ số đối xứng của pic thấp (pic doãng), số đĩa lý thuyết thấp… [32], [63], [87], [125].
- Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp bằng cột pha tĩnh đối quang:
Sử dụng một chất ĐPĐQ tạo liên kết hóa học với pha tĩnh để tạo ra một pha tĩnh đối quang (CSP). Pha tĩnh đối quang sẽ phản ứng với chất phân tích để tạo thành phức hợp đồng phân không đối quang tạm thời. Lực liên kết của pha tĩnh với các đồng phân khác nhau nên khả năng lưu giữ chúng trên pha tĩnh khác nhau. Vì vậy các ĐPĐQ sẽ có thời gian lưu khác nhau khi rửa giải sắc ký. So với phương pháp thêm tác nhân chọn lọc hoạt quang vào pha động, phương pháp HPLC phân tách ĐPĐQ trực tiếp bằng pha tĩnh đối quang có nhiều ứng dụng hơn [32], [87], [187].
Cho đến nay hơn 100 loại cột HPLC pha tĩnh hoạt quang đã được thương mại hóa.
Tuy vậy, không có cột nào được coi là đa năng, có khả năng phân lập mọi chất bất đối.
Yếu tố để phân lập thành công một hỗn hợp racemic bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha tĩnh bất đối là nắm bắt được cơ chế nhận diện chất bất đối của pha tĩnh, đặc điểm của chất cần phân tích và pha động [51], [77], [87], [119].
Tóm tắt một số nghiên cứu phân tích dược chất đối quang trong nguyên liệu, chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học bằng các phương pháp HPLC và LC-MS được trình bày ở Bảng 1.5 và Bảng 1.6 [51].
22
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích ĐPĐQ trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC
Hoạt chất Cột* Pha động (v/v) LOD Đầu dò Kiểu mẫu Tài liệu tham khảo Arginin Chirobiotic T MeOH : NaH2PO4 50mM, pH 4,6
(20:80)
0,0025%
0,25 àg/ml
UV 214 nm Viên nang [90]
Atropin Chiral AGP MeCN : amoni acetat 10 mM pH 6,2 (3:97)
< 5% UV, MS1 Nguyên liệu [40]
Citalopram Shim-pack CN TEA 0,1%/đệm acetat (pH 4,0) : MeCN (90+10, v/v) và 12 mM β-CD
5,51 ng/ml UV 240 nm Viên nén [60]
Donepezil Chiralcel OD n-hexan : 2-PrOH : TEA (87:12,9:0,1) 20 ng/ml UV 268nm Viên nén [147]
Levetiracetam Chiralpak AD n-hexan : 2-PrOH (90:10) 900 ng/ml UV 210 nm Nguyên liệu [150]
Methotrexat Chiralcel OJ MeCN : nước - UV 303 nm Nguyên liệu [62]
Metoprolol Chiralcel OD DEA 10mM, nước 28 mM và HAc 5 mM trong n-hexan : 2-PrOH (85:15)
- UV 273 nm Nguyên liệu [180]
Nadolol Chiralcel OD n-hexan : EtOH : DEA (80:20:0,4) - UV 254 nm Nguyên liệu [20]
Paroxetin Chiralpak AD n-hexan : EtOH : DEA (94:6:0,5) 0,2%
2ng
UV 296 nm Nguyên liệu, viên nén
[73]
Propranolol Chiralcel OD n-hexan : EtOH (75:25) - UV 280 nm Viên nén [162]
Terbutalin Sumichiral OA- 4900
n-hexan : ethylacetat : MeOH : TFA 0,05% UV 276 nm Nguyên liệu [80]
Thyroxin Chiral AX QN-1 MeCN : amoni acetat 0,05 mM pH 4,5 0,1 àg/ml UV 240 nm Viờn nộn [110]
Timolol Chiralcel OD n-hexan : 2-PrOH : DEA (65:35:1) 0,02% UV 297 nm Nguyên liệu [127]
(*) Thành phần pha tĩnh: Chiralpak AD: Amylose tris (3,5-dimethylphenyl carbamat); Chiral AGP: α1-Glycoprotein; Chiralcel OD:
Cellulose tris (3,5-dimethylphenyl carbamat); Chiralcel OJ: Cellulose tris (4-methyl benzoat); Chiral AX QN-1: Tert butyl carbamoxylated quinin; Chirobiotic T: Teicoplanin; Sumichiral OA-4900: Hydroxypropyl-β-CD và Shim-pack CN: Cyanopropyl.
23
Bảng 1.6. Một số nghiên cứu phân tích ĐPĐQ trong dịch sinh học bằng phương pháp HPLC và LC-MS
Hoạt chất Tên cột – thành phần pha tĩnh Pha động Kiểu mẫu LOQ TLTK Acid 2 –
hydroxyglutaric
Chirobiotic – R Ristocetin A
MeOH : 5mM TEA trong đệm (pH7,0) (9:1)
Nước tiểu Không xác định
[151]
Albuterol Chirobiotic – T Teicoplanin
MeOH : HAc : 28% NH4OH (1000:5:1)
Huyết tương 0,25 ng/ml [98]
Amlodipin Chiral AGP α1-Glycoprotein
10 mM đệm acetat (pH4,5) : 1-PrOH (99:1)
Huyết tương 0,1 ng/ml [179]
Amphetamin, Methamphetamin
ULTRON ES PhCD Phenylcarbamat-β-CD
10 mM ammoni acetat, pH 5,0 : MeOH : MeCN (6:3:1)
Nước tiểu 20 ng/ml, 50 ng/ml
[107]
Benzodiazepin và chuyển hóa
Pirkle-DNBL
Dinitrobenzoyl leucin
MeCN : 25mM ammonium formiat, pH 7 (40:60)
Microsome Không xác định
[194]
Donepezil Biooptick AV-1 Avidin
10 mM acid formic : MeOH (75:25)
Huyết tương 0,020 ng/ml [129]
Felodipin Chiralcel OJ
Cellulose tris (4-methyl benzoat)
2-PrOH : isohexan (11:89) Huyết tương 0,25 nM (MS)
[121]
Fluoxetin Chirobiotic – V Vancomycin
MeOH với 0,075%
ammonium trifluoroacetic
Huyết tương 2 ng/ml [169]
Ketoprofen Chirex3005
R-Naphthylglycin và 3,5-dinitrobenzoic acid
MeOH : 60 mM ammoni acetat, pH 3,5 (95:5)
Huyết tương 0,05 ng/ml [59]
Lercanidipin Chiralpak AD
Amylose tris (3,5-dimethylphenyl carbamat)
n-hexan : EtOH : DEA (95:5:0,1)
Huyết tương 25 ng/ml (MS)
[97]
Lorazepam Chiralcel OD
Cellulose tris (3,5-dimethylphenyl carbamat)
MeCN : H2O : Acid acetic (80:20:0,1)
Huyết tương 0,2–1 ng/ml [104], [140]
Omeprazol và chất chuyển hóa
Chiralpark AD
Amylose tris (3,5-dimethylphenyl carbamat)
MeCN : 20mM ammoni acetat pH 4,65 (35:65)
Huyết tương Không xác định
[105], [176]
Warfarin Cyclobond I-2000 – (β-cyclodextrin) MeCN-CH3COOH-TEA (1000:3:2,5)
Huyết tương 1,0 ng/ml [137]
c. Phương pháp điện di mao quản
Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán trong dung dịch điện giải khi có dòng điện đi qua. Cation di chuyển về phía cực âm, anion di chuyển về phía cực dương. Điện di mao quản (CE) là phương pháp phân tách các chất dựa vào sự khác nhau về tốc độ chuyển động của chúng dưới tác dụng của lực điện trường trong một mao quản hẹp có chứa dung dịch đệm (dung dịch điện ly nền). Quá trình tách dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất tan trong mao quản silica có chiều dài khoảng 25-100 cm, đường kính trong khoảng 25-100 μm. Điện thế một chiều áp vào hai đầu mao quản 10-30 kV (cường độ điện trường có thể đến 500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách. Các chất phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản nhờ một đầu dò thích hợp [3], [4], [142].
- Cơ chế điện di [3], [4], [142]: Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản silica chứa dung dịch đệm điện ly nền có pH thích hợp, thì nhóm silanol (SiOH) ở trên thành trong của mao quản sẽ giải phóng ion hydrogen (H+) vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện âm. Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần trong môi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta (ξ). Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo cả khối dung dịch trong mao quản đi về catod. Sự chuyển động của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm (Electro-osmotic flow - EOF) – Hình 1.12 [142].
Hình 1.12. Sự hình thành dòng điện thẩm trong phương pháp CE
Điện tích bề mặt trong của thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH của dung dịch điện ly nền, do đó trị số EOF thay đổi theo pH. Ở pH thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ. Ở pH cao hơn, nhóm silanol bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng. Ngoài pH dung dịch đệm, dòng EOF còn phụ thuộc vào các yếu tố như lực ion của dung dịch (lực ion tăng lên, thế Zeta giảm), hằng số điện môi của dung dịch (hằng số điện môi giảm, thế Zeta giảm)...
- Phân tích ĐPĐQ bằng CE: Hiện nay, phương pháp CE phân tách các ĐPĐQ đã trở nên phổ biến như một kỹ thuật bổ sung hoặc thay thế cho phương pháp HPLC. Nhiều nguyên tắc tách ĐPĐQ áp dụng thành công ở HPLC đã được chuyển giao cho CE.
Phương pháp CE có một số ưu điểm như hiệu lực tách cao; xây dựng phương pháp thuận lợi do có khả năng kết hợp nhiều tác nhân chọn lọc đối quang trong dung dịch điện ly nền; sử dụng một lượng nhỏ hóa chất và dung môi, chi phí phân tích thấp và ít ảnh hưởng đến môi trường. CE phù hợp với các hợp chất mang điện tích và phân cực hơn các phương pháp sắc ký.
Tương tự như các phương pháp sắc ký, phương pháp tách ĐPĐQ bằng CE có thể thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếp [30], [70], [142], [154]. Phương pháp gián tiếp chủ yếu được áp dụng cho phân tách các ĐPĐQ của acid amin. Phương pháp trực tiếp được sử dụng rộng rãi hơn so với phương pháp gián tiếp. Trong phương pháp trực tiếp, tác nhân chọn lọc đối quang hoặc có thể được thêm vào dung dịch điện ly nền hoặc được gắn lên thành mao quản, hoặc được cố định hay gắn lên các hệ gel để tạo một môi trường chọn lọc đối quang tương tác với hai ĐPĐQ trong suốt quá trình điện di dựa trên sự hình thành phức đồng phân lập thể không đối quang tạm thời. Các phức tạm thời di chuyển về phía đầu dò với vận tốc khác nhau do chúng có hằng số bền (linh độ điện di) khác nhau [30], [70], [196].
Nhiều tác nhân chọn lọc hoạt quang được sử dụng để phân tách ĐPĐQ bằng HPLC cũng được sử dụng trong phương pháp CE. Chất chọn lọc đối quang thường dùng trong phương pháp CE bao gồm CD và dẫn chất (-, - và -CD;
hydroxypropylat-, methyl-, hydroxyethyl-, hydroxypropyl-, acetyl-, sulphobutylether-, methylamino- và carboxymethyl-CD…); một số ether dạng vòng (các polyether macrocyclic); một số kháng sinh nhóm macrocyclic (vancomycin, rifamycin B, ristocetin A…) và một số protein như albumin người, BSA…[24], [30], [32], [53].
Trong số các tác nhân chọn lọc hoạt quang nêu trên, nhóm CD và dẫn chất (đặc biệt là