1.2. PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
1.2.1. Các kỹ thuật xử lý, chiết tách dược chất trong mẫu sinh học
Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường có nồng độ dược chất thấp và chứa một tỷ lệ lớn các protein, các chất nội sinh làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất. Vì vậy mẫu cần phải được chiết tách, xử lý để loại bỏ các tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ bền và độ
nhạy của thiết bị phân tích. Lựa chọn kỹ thuật xử lý mẫu, tách chiết hoạt chất cần phân tích trong các mẫu dịch sinh học cần phải căn cứ vào: đặc điểm hóa lý của hoạt chất;
đặc điểm mẫu sinh học và đặc điểm của phương pháp phân tích. Một kỹ thuật xử lý mẫu là phù hợp nếu: chiết được dược chất cần phân tích với độ thu hồi cao và lặp lại;
quy trình xử lý mẫu đơn giản, kinh tế và an toàn; loại bỏ được tạp chất và các ảnh hưởng của nền mẫu đối với phương pháp phân tích. Hiện nay, để xử lý mẫu dịch sinh học, người ta hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản đó là: tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [113], [117], [172], [175]. Ngoài ra, trong một số trường hợp, các tác giả có thể sử dụng đồng thời hai hoặc cả ba kỹ thuật xử lý mẫu cơ bản nêu trên để tăng độ thu hồi hoạt chất cũng như loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu.
1.2.1.1. Kỹ thuật tủa protein
Tủa protein là phương pháp đơn giản để chiết các chất phân tích khỏi nền mẫu. Tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học bao gồm: dung môi hữu cơ, muối vô cơ; acid và nhiệt độ. Ngoài ra, cũng có thể tủa protein bằng các polymer không ion hoặc các ion kim loại hoặc loại bỏ protein và các phân tử có khối lượng lớn bằng phương pháp siêu lọc [113], [117], [175].
- Gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ: Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn như nước, dimethylsulphoxid… có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ như acetonitril, methanol… ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường làm giảm độ hòa tan của protein và xảy ra kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường.
- Tủa protein bằng muối vô cơ: Một số muối như (NH4)2SO4, NaCl… vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein gây ra hiện tượng tủa protein.
- Tủa protein do thay đổi pH: Mỗi protein sẽ có một điểm đẳng điện (pI). Ở giá trị pH
= pI, phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất và dễ bị kết tủa. Các tác nhân gây tủa protein do thay đổi pH thường là các acid như trichloroacetic, trifluoracetic, perchloric… Để gây tủa protein hiệu quả, thường dùng acid trichloroacetic ở nồng độ 3-5% và acid perchloric ở nồng 15% so với lượng mẫu. Phương pháp tủa protein bằng acid được áp dụng cho những
hoạt chất dễ tan trong nước và bền với acid.
Kỹ thuật tủa protein có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện và tốn ít dung môi. Tuy vậy, kỹ thuật tủa protein do chỉ có thể loại bỏ được một phần protein và peptid nên mẫu sau khi xử lý có nhiều thành phần tạp chất có thể làm tăng áp suất ngược trên hệ thống sắc ký ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột phân tích và gây nhiễu đường nền, ảnh hưởng đến kết quả xác định nồng độ dược chất có trong mẫu khi phân tích bằng các phương pháp sắc ký, đặc biệt là phương pháp LC – MS [31], [56], [117], [141].
1.2.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Chiết lỏng - lỏng là phương pháp được dùng phổ biến để chuyển chất phân tích hoà tan trong một dung môi này sang dung môi khác không đồng tan. Thực tế thường dùng cân bằng nước - dung môi hữu cơ không tan trong nước (n-hexan, diethylether, dichloromethan…) để loại bớt tạp trong các mẫu dịch sinh học. Hiệu suất chiết hoạt chất từ pha nước phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết; tính phân cực của dung môi chiết; pH của pha nước; hệ số/hằng số phân bố của hoạt chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau. Để tăng hiệu suất chiết hoạt chất từ pha nước có thể áp dụng những giải pháp sau [113], [117], [172], [175]:
- Thay đổi dung môi hữu cơ chiết (có thể phối hợp một vài dung môi hữu cơ khác nhau theo các tỷ lệ khác nhau) hoặc tăng thể tích dung môi chiết.
- Nếu chất phân tích ở dạng ion hoặc có khả năng ion hóa, hệ số phân bố của dược chất có thể tăng lên bằng cách ức chế sự ion hóa của bản thân chất đó (điều chỉnh pH hoặc chiết tạo cặp ion…) nhờ đó hoạt chất có thể hòa tan tốt hơn trong dung môi.
- Ảnh hưởng của việc giảm nồng độ muối trong mẫu có thể được sử dụng để tăng nồng độ chất phân tích trong phân tích.
- Các ion kim loại có thể tạo thành một phức hợp kỵ nước với hoạt chất cần phân tích, nhờ đó hiệu suất chiết hoạt chất với dung môi hữu cơ có thể được tăng lên.
Ngoài ra, có thể tiến hành chiết nhiều lần, chiết ngược hoặc chiết liên tục để tăng hiệu suất chiết hoạt chất của quy trình. Tuy vậy, cần căn cứ vào số lượng mẫu; thể tích mẫu; điều kiện áp dụng quy trình chiết; thời gian thực hiện quy trình chiết… để có thể xây dựng được quy trình chiết phù hợp. Với kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, mẫu thu được tương đối sạch, có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều dược chất, đơn giản, dễ thực hiện phù hợp với điều kiện và các thiết bị ở hầu hết các phòng thí nghiệm. Tuy vậy, kỹ thuật chiết lỏng – lỏng cũng có một số nhược điểm như: sử dụng nhiều dung môi ảnh hưởng tới môi trường và sức khỏe người phân tích; kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
mất nhiều thời gian; cần phải bay hơi dung môi chiết trước khi phân tích; nhũ tương có thể hình thành trong quá trình chiết gây sai lệch kết quả phân tích. Hiện nay, chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật xử lý mẫu được dùng phổ biến để chiết chất phân tích trong nền mẫu huyết tương [56], [117], [141], [172].
1.2.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn
Nguyên lý của chiết pha rắn (SPE) tương tự như chiết lỏng – lỏng, đó là dựa vào sự phân bố của chất tan vào hai pha không trộn lẫn với nhau. Kỹ thuật SPE dựa vào sự phân bố giữa một pha lỏng (nền mẫu hoặc dung dịch chất phân tích) và một pha rắn (chất hấp phụ). Các chất phân tích có thể được hấp phụ vào pha rắn hoặc giữ lại trong pha lỏng khi nó đi qua pha rắn. Khi hai pha cân bằng, chúng có thể tách ra nhờ gạn, lọc, ly tâm hoặc một quá trình khác tương tự. Nếu chất phân tích bị hấp phụ trên bề mặt pha rắn, chúng có thể được rửa giải bằng cách sử dụng dung môi phù hợp [3], [56], [117], [172]. Các giai đoạn chính của kỹ thuật chiết SPE được mô tả ở Hình 1.14.
Hình 1.14. Qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật SPE [117]
Qui trình chiết SPE bao gồm 4 bước chính [3], [113], [117], [172], [175]:
- Hoạt hóa cột bằng các dung môi hoặc dung dịch đệm thích hợp.
- Nạp mẫu: mẫu được hòa tan trong dung môi và cho chảy qua cột.
- Rửa: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho chảy qua cột để loại tạp.
- Rửa giải: dùng dung môi thích hợp để đẩy chất phân tích ra khỏi cột.
Trong kỹ thuật SPE, sự tương tác giữa hoạt chất cần phân tích, pha tĩnh và pha động quyết định hiệu suất chiết của quy trình. Cơ chế lưu giữ chính trong SPE có thể dựa trên lực Van der Waals, lực liên kết hydro, tương tác phân cực và tương tác điện tích. Mỗi chất hấp phụ đều mang một nhóm thuộc tính riêng mà có thể áp dụng để giải quyết các vấn đề khác nhau trong xử lý mẫu. Tùy thuộc vào bản chất của chất phân
tích mà người ta sử dụng các loại cột chứa pha tĩnh có bản chất khác nhau và các hệ dung môi khác nhau để chiết tách [3], [56], [172]. Các pha tĩnh và cơ chế liên kết, rửa giải của SPE tương tự như HPLC.
Do có nhiều loại cột chiết, cơ chế cột chiết đa dạng, phù hợp với chất phân tích nên kỹ thuật chiết SPE thường cho hiệu suất chiết cao, ổn định, lặp lại, nền mẫu sạch ít gây ra hiện tượng ảnh hưởng của nền mẫu. Đồng thời, hệ số làm giàu mẫu của kỹ thuật SPE thường cao hơn rất nhiều so với các kỹ thuật xử lý mẫu khác (trong kỹ thuật SPE thể tích của pha rắn thường nhỏ hơn nhiều lần so với pha lỏng). Kỹ thuật SPE chỉ sử dụng một lượng dung môi nhỏ để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột, an toàn ít độc hại với môi trường và nhân viên phân tích hơn. Kỹ thuật SPE thích hợp để tự động hóa, xử lý cùng lúc nhiều mẫu. Tuy vậy, kỹ thuật SPE cũng có một số nhược điểm như: khó lưu giữ chất phân cực mạnh (không thích hợp để phân tích các chất dễ tan, tan hoàn toàn trong nước; chất phân tích ở dạng ion…); tính chọn lọc chỉ dựa vào tương tác phân cực, tương tác kỵ nước, chưa dựa vào đặc điểm của chất phân tích nên hiệu suất và tính đặc hiệu của kỹ thuật chiết chưa cao; cột chiết pha rắn đắt tiền, nên chi phí phân tích cao [56], [117], [141], [172].