2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu trên thực nghiệm
*Mục đích: xác định các dấu hiệu ngộ độc và xác định LD50 của thuốc
“Thông mạch sơ lạc hoàn” trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon.
*Cách tiến hành
- Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm.
- Mười lô chuột nhắt trắng, mỗi lô mười con, được uống thuốc với liều tăng dần từ 76g dược liệu/kg đến 229g dược liệu/kg, với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,2ml/10g cân nặng, uống ba lần/24 giờ, mỗi lần cách nhau hai giờ.
- Đường dùng: cho uống bằng cách bơm hỗn dịch vào thẳng dạ dày chuột.
- Thời gian theo dừi: một tuần.
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ:
- Theo dừi tỡnh trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lụ trong 72 giờ. Sau đú tiếp tục theo dừi tỡnh trạng chung của chuột đến hết ngày thứ bảy sau khi uống chế phẩm thử.
- Quan sát các hoạt động ăn uống và các biểu hiện khác của chuột, ghi giờ xuất hiện các triệu chứng bất thường, tỷ lệ chuột chết trong mỗi lô. Nếu lô nào có chuột bị chết, mổ chuột kiểm tra đại thể để đánh giá tác dụng gây độc cấp đối với cơ quan chịu tác động chính của thuốc.
2.3.1.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
*Mục đích: thăm dò độc tính liều nhắc lại ở thỏ khi cho uống thuốc liên tục trong bốn tuần.
*Cách tiến hành
- Thỏ được chia thành ba lô, mỗi lô mười con, được nhốt riêng mỗi chuồng một con.
+ Lô chứng cho uống nước cất, 5ml/kg/ngày.
+ Lô trị 1: uống thuốc TMSLH 13,61 g/kg/ngày (tương đương với liều dùng cho người, tính theo hệ số 3).
+ Lô trị 2: Uống thuốc TMSLH liều 40,82 g/kg/ngày (gấp ba lần liều ở lô trị 1).
- Tất cả thỏ được uống nước cất và thuốc thử với thể tích tương đương 5ml/kg/ngày, mỗi ngày một lần vào 8 giờ sáng, liên tục trong bốn tuần.
- Lấy máu lần đầu để xác định các thông số bình thường của thỏ trước khi uống.
- Sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc: lấy máu thỏ để kiểm tra các chỉ số sau thời gian uống thuốc.
- Sau khi ngừng thuốc hai tuần: lấy máu thỏ để kiểm tra các chỉ số sau khi ngừng thuốc hai tuần.
- So sánh các chỉ số sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc và sau khi ngừng thuốc hai tuần với các chỉ số trước khi uống thuốc.
- Kết thúc thí nghiệm: mổ 30% thỏ ở lô chứng và 30% thỏ ở lô dùng thuốc ở thời điểm sau uống thuốc bốn tuần và sau ngừng thuốc hai tuần, quan sát đại thể và vi thể các cơ quan như: gan, thận...
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ
- Tình trạng chung (hoạt động, mắt, lông, ăn uống, phân...) và cân nặng của thỏ.
- Đánh giá chức năng tạo máu thông qua các chỉ số: số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu. Các chỉ số trên được định lượng trên máy xét nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hãng ABX - Diagnostic (Pháp).
- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và một số chất: AST, ALT, bilirubin toàn phần, protein toàn phần, cholesterol. Các chỉ số trên được định lượng trên máy xét nghiệm hóa sinh Screen master của hãng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Đánh giá chức năng thận bằng định lượng creatinin huyết thanh, được định lượng trên máy xét nghiệm hóa sinh Screen master của hãng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Mô bệnh học: kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc đại thể và vi thể của gan và thận của 30% số thỏ ở mỗi lô.
Xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu được thực hiện tại Bộ môn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội.
Xét nghiệm đại thể, vi thể gan, thận... được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Trường Đại học Y Hà Nội.
2.3.1.3. Nghiên cứu tác dụng trên tim mạch của chế phẩm TMSLH
* Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của chế phẩm TMSLH
- Chó được bộc lộ tĩnh mạch đùi và được gây mê bằng thiopental dung dịch 5% với liều 0,02 g/kg.
- Ghi huyết áp động mạch đùi qua huyết áp kế thủy ngân. Hệ thống cột thủy ngân được nối với thiết bị cảm ứng điện ADI đo huyết áp, điện tim, hô hấp và nhiệt độ dùng riêng cho động vật.
- Kết quả được hiển thị trên một máy tính mắc nối tiếp. Thuốc thử được đưa theo đường uống liều 6,80 g/kg/ngày tương đương liều lâm sàng (đã được ngoại suy liều trên chó theo hệ số 2).
- Theo dừi huyết ỏp: cỏc chỉ số HAtt, HAttr, HAtb, tần số tim... khi chưa uống thuốc thử và sau khi uống thuốc thử 30 phút/lần, liên tục trong sáu giờ.
Nghiên cứu ảnh hưởng của TMSLH trên huyết áp chó thông qua hệ adrenergic và hệ cholinergic
Bước 1: theo dừi huyết ỏp bỡnh thường (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 2: tiêm adrenalin lần 1 liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đánh giá ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ adrenergic hoặc tiêm acetylcholin lần 1
liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đánh giá ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ cholinergic (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 3: uống TMSLH liều 6,80 g/kg/ngày tương đương liều lâm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2), theo dừi cỏc chỉ số huyết ỏp tại bốn thời điểm sau uống thuốc thử 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 4: kết thúc bước 3, tiêm adrenalin lần thứ hai liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đánh giá ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ adrenergic hoặc tiêm acetylcholin lần thứ hai liều gấp mười lần so với lần thứ nhất (0,3 mg/kg đường tĩnh mạch) với đánh giá ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ cholinergic (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
* Nghiên cứu tác dụng giãn mạch của chế phẩm TMSLH - Tai thỏ được cô lập theo phương pháp Kravkov.
- Cách pha dung dịch truyền: pha dung dịch TMSLH với liều 4,5ml; 9ml;
45ml; 90ml; 180ml/1000ml Ringer vừa đủ được dung dịch thuốc thử ở các nồng độ 0,45%; 0,9%; 4,5%; 9%; 18%.
- Truyền dung dịch thuốc thử đã pha ở độ cao 100 cm vào động mạch giữa.
- Theo dừi số giọt dung dịch chảy ra ở hai tĩnh mạch vành tai trong một phút lúc trước và sau khi dùng thuốc thử. Nếu số giọt chảy ra ở hai tĩnh mạch rìa tai tăng chứng tỏ mạch giãn hoặc ngược lại nếu số giọt giảm chứng tỏ mạch co.