Dạng thuốc nghiờn cứu trờn thực nghiệm được chế từ viờn hoàn TMSLH thành cao lỏng cú tỷ lệ 5,67g dược liệu/1ml cao do Khoa YHCT Bệnh viện Đa khoa Xanh - Pụn bào chế và được thử độc tớnh cấp LD50 và độc tớnh bỏn trường diễn tại Bộ mụn Dược lý Trường Đại học Y khoa Hà Nội.
Kết quả thửđộc tớnh cấp LD50 trờn chuột nhắt trắng với liều tăng dần từ 76g dược liệu/1kg trọng lượng đến 229g dược liệu/1kg trọng lượng (liều tối đa cú thể uống được). Theo dừi sau 72 giờ và sau bảy ngày uống thuốc khụng thấy dấu hiệu ngộ độc nào ở chuột. Do vậy, khụng xỏc định được liều chết LD50 của thuốc.
Trong thực tế lõm sàng việc điều trị NMN sau giai đoạn cấp thường kộo dài. Vỡ vậy đểđỏnh giỏ tớnh an toàn của bài thuốc, tụi tiếp tục nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn trờn thỏ thực nghiệm. Nghiờn cứu tiến hành trờn hai lụ: Lụ trị 1 cho thỏ uống liều 13,61g/kg/ngày (tương đương với liều dựng cho người), lụ trị 2 cho thỏ uống liều cao gấp ba lần (40,82g/kg/ngày) liờn tục trong bốn tuần và tiếp tục theo dừi sau ngừng thuốc hai tuần. Kết quả nghiờn
cứu cho thấy, tỡnh trạng chung trong suốt thời gian uống thuốc tất cả cỏc lụ thỏ vẫn ăn uống bỡnh thường. Cõn nặng của tất cả cỏc thỏ đều tăng so với trước khi nghiờn cứu. Mức độ gia tăng trọng lượng của thỏ ở cả hai lụ trị trong bốn tuần và theo dừi hai tuần sau khi ngừng thuốc khụng cú sự khỏc biệt so với lụ chứng (p > 0,05). Như vậy, cú thể kết luận rằng TMSLH khụng làm ảnh hưởng xấu đến tỡnh trạng chung và mức độ tăng trưởng của thỏ khi uống thuốc liờn tục trong bốn tuần, kể cả ở lụ thỏ uống liều cao gấp ba lần liều cú tỏc dụng tương đương trờn người.
4.1.1.1. Ảnh hưởng của TMSLH đến chức năng tạo mỏu
Mỏu là một tổ chức quan trọng vỡ mỏu cú mối liờn quan mật thiết với mọi chức năng, cơ quan trong cơ thể [17]. Về mặt sinh lý, mỏu chịu ảnh hưởng của tất cả cỏc tổ chức đú nhưng đồng thời cũng bị ảnh hưởng và phản ỏnh tỡnh trạng của cơ quan tạo mỏu [31]. Nếu thuốc sử dụng cú ảnh hưởng đến cơ quan tạo mỏu, thành phần của mỏu sẽ bị thay đổi [71]. Vỡ vậy cú thể nhận định qua cỏc xột nghiệm về số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, cụng thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu của động vật thớ nghiệm. Trong nghiờn cứu này cỏc chỉ số trờn của thỏở cả hai lụ trị 1 và lụ trị 2, sau hai tuần và bốn tuần uống TMSLH và lụ chứng, sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa thống kờ (p > 0,05). Huyết sắc tố trong hồng cầu cú nhiệm vụ tiếp nhận oxy đi qua phổi và nhường lại oxy đú cho cỏc tế bào khi qua mao mạch [17]. Định lượng huyết sắc tố cho biết chức năng của hồng cầu. Hematocrit là tỷ lệ phần trăm giữa khối hồng cầu và mỏu toàn phần. Nếu thuốc làm thay đổi số lượng hồng cầu hoặc làm mất nước hay ứ nước trong tế bào mỏu thỡ chỉ số này sẽ thay đổi [31]. Trong nghiờn cứu này, số lượng huyết sắc tố và hematocrit trờn thỏ thớ nghiệm ở hai lụ trị 1 và lụ trị 2 dựng TMSLH và lụ chứng đều trong giới hạn bỡnh thường, thay đổi khụng cú ý nghĩa thống kờ so với trước khi dựng thuốc và lụ chứng ở tất cả cỏc thời điểm hai tuần, bốn tuần uống thuốc và hai tuần ngừng thuốc.
Cỏc kết quả của hệ thống tạo mỏu trờn động vật thực nghiệm khi dựng TMSLH với liều 13,61g/kg/ngày và 40,82g/kg/ngày liờn tục từ hai tuần đến
bốn tuần và hai tuần ngừng thuốc cho thấy TMSLH khụng làm ảnh hưởng đến: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, cụng thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu, huyết sắc tố và hematocrit so với trước uống thuốc và so với lụ chứng (p > 0,05).
4.1.1.2. Ảnh hưởng của TMSLH đến chức năng gan
Trong cơ thể, gan là cơ quan đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng, đặc biệt là chức năng thải độc. Thuốc vào cơ thể cú thể gõy độc với gan, làm ảnh hưởng đến chức năng gan, tựy lượng thuốc ớt hay nhiều mà gan phải cú nhiệm vụ chuyển húa đồng thời khử độc. Nghiờn cứu ảnh hưởng của thuốc đối với chức năng gan là rất cần thiết khi nghiờn cứu độ an toàn của một thuốc [31]. Vỡ vậy, khi nghiờn cứu đưa vào cơ thể một lượng thuốc và kộo dài sẽ ảnh hưởng đến tế bào gan, biểu hiện bằng sự suy giảm chức năng gan, tế bào gan bị hủy hoại. Tỏc dụng hủy hoại tế bào gan của thuốc thường được đỏnh giỏ bằng việc đo hoạt độ cỏc enzym nguồn gốc gan trong huyết thanh. Sự tăng hoạt độ cỏc enzym tế bào gan AST, ALT trong huyết thanh động vật thực nghiệm thường gắn liền với độc tớnh của thuốc do hoại tử tế bào gan và một số tế bào khỏc trong cơ thể. ALT là enzym cú nhiều nhất ở gan, cư trỳ trong bào tương của tế bào nhu mụ gan; khi tổn thương hủy hoại tế bào gan, chỉ cần thay đổi tớnh thẩm thấu của màng tế bào gan, nồng độ ALT đó tăng cao. AST cư trỳ trong ty thể, chỉ một phần ba AST cư trỳ trong bào tương của tế bào gan, khi tổn thương tế bào gan ở mức độ dưới tế bào, AST trong ty thể được giải phúng ra mỏu ngoại vi [71]. Do vậy, trong tổn thương tế bào gan núi chung nồng độ ALT luụn tăng cao hơn AST. Trong nghiờn cứu này, nồng độ enzym ALT và AST khụng tăng trong huyết thanh ở cả ba thời điểm hai tuần, bốn tuần uống thuốc liờn tục và hai tuần ngừng thuốc với liều 13,61g/kg/ngày và 40,82g/kg/ngày, so với trước uống thuốc và so với lụ chứng (p > 0,05), chứng tỏ thuốc TMSLH khụng gõy tổn thương tế bào gan thỏ thực nghiệm.
Gan tham gia cỏc quỏ trỡnh thoỏi hoỏ hemoglobin thành bilirubin và đào thải bilirubin theo mật. Xột nghiệm định lượng nồng độ bilirubin trong huyết
thanh để thăm dũ chức năng bài tiết và chuyển hoỏ mật của gan [17]. Kết quả của nghiờn cứu này cho thấy nồng độ bilirubin toàn phần trong mỏu thỏ ở hai lụ trị khụng thay đổi sau hai tuần, bốn tuần uống thuốc thử và sau khi ngừng thuốc hai tuần so với trước khi uống thuốc và so với lụ chứng. Điều này cho thấy thỏ uống thuốc thử TMSLH liều 13,61g/kg/ngày và 40,82g/kg/ngày liờn tục trong bốn tuần khụng ảnh hưởng đến chức năng bài tiết và chuyển hoỏ mật của gan.
Ngoài ra, gan cũn cú chức năng chuyển húa cỏc chất nội sinh, ngoại sinh và quỏ trỡnh chuyển hoỏ cỏc chất, trong đú cú chuyển hoỏ protid, lipid, porphyrin... [17], [31].
Protein được tổng hợp ở gan từ cỏc acid amin; để đỏnh giỏ một phần chức năng chuyển hoỏ protid của gan tiến hành định lượng nồng độ protein trong huyết thanh. Kết quả của nghiờn cứu này cho thấy, ở hai lụ uống thuốc thử TMSLH nồng độ protein trong huyết thanh thỏ thực nghiệm khụng thay đổi tại cỏc thời điểm sau hai tuần, sau bốn tuần uống thuốc liờn tục và sau khi ngừng thuốc hai tuần so với trước khi uống thuốc và so với lụ chứng. Từđú cho thấy TMSLH liều 13,61g/kg/ngày và 40,82g/kg/ngày, uống liờn tục trong bốn tuần trờn thỏ khụng làm ảnh hưởng đến chức năng chuyển hoỏ protid của gan.
4.1.1.3. Ảnh hưởng của TMSLH đến chức năng thận
Để đảm bảo sự hằng định nội mụi, thận là cơ quan cú vai trũ quan trọng nhất. Khi đưa thuốc vào cơ thể cú thể gõy tổn thương thận, ảnh hưởng đến chức năng thận. Định lượng nồng độ creatinin trong huyết thanh giỳp đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc đến chức năng thận [71]. Creatinin là chất chuyển hoỏ cuối cựng, sản phẩm phõn huỷ của creatin phosphat, nồng độ creatinin khụng phụ thuộc vào chế độ ăn. Hiện nay đõy là một chỉ số thường dựng để đỏnh giỏ và theo dừi chức năng thận vỡ khi cú tổn thương thận, creatinin tăng sớm hơn và tin cậy hơn ure, nồng độ creatinin trong mỏu càng cao biểu hiện suy chức năng thận càng nặng [31]. Kết quả nghiờn cứu cho thấy sau hai tuần, bốn tuần uống thuốc thử liờn tục và sau ngừng thuốc hai tuần, nồng độ creatinin trong huyết thanh thỏ ở hai lụ trị khụng thay đổi so với trước khi
uống thuốc và so với lụ chứng. Như vậy chứng tỏ TMSLH uống liờn tục trong bốn tuần khụng ảnh hưởng đến chức năng thận.
4.1.1.4. Ảnh hưởng của TMSLH trờn mụ bệnh học đại thể và vi thể của gan và thận thỏ thực nghiệm
*Đại thể: sau bốn tuần dựng thuốc và hai tuần ngừng thuốc, quan sỏt đại thể khụng thấy cú cỏc tổn thương tại cỏc cơ quan của thỏ (tim, phổi, gan, lỏch, tuỵ, thận và hệ thống tiờu hoỏ).
*Vi thể(xin tham khảo một sốảnh minh họa ở phụ lục 6)
- Hỡnh thỏi vi thể ở gan: cấu trỳc vi thể gan của thỏ lụ trị 1 và lụ trị 2 (sau khi uống thuốc bốn tuần và sau hai tuần ngừng thuốc) đa số cỏc tế bào gan bỡnh thường, khụng thoỏi hoỏ, khụng hoại tử. Khoảng cửa khụng viờm, cỏc tĩnh mạch trung tõm và cỏc xoang mạch khụng sung huyết. Một số bệnh phẩm, cỏc tế bào gan cú bào tương sang, cú thoỏi húa hạt.
- Hỡnh thỏi vi thể ở thận: hầu hết cấu trỳc vi thể thận ở lụ trị 1 sau khi uống thuốc bốn tuần đều cú cầu thận kớch thước bỡnh thường, khoảng Bowman khụng hẹp khụng sung huyết, ống thận khụng cú tổn thương; sau hai tuần ngừng thuốc tất cả cỏc thỏ đều cú cầu thận sung huyết nhẹ, ống thận khụng cú tổn thương. Lụ trị 2 hầu hết cầu thận bỡnh thường, ở thời điểm sau hai tuần ngừng thuốc đa số bệnh phẩm cỏc cầu thận sung huyết, tất cả cỏc bệnh phẩm ống thận khụng cú tổn thương, khụng thoỏi húa long tế bào.
Những tổn thương này khụng đặc hiệu và cũng thường gặp ở lụ chứng. Tuy cú một vài những tổn thương ở cấu trỳc vi thể của gan, thận thỏở cả hai lụ thuốc thử nhưng cỏc xột nghiệm đỏnh giỏ chức năng gan thận khụng cú sự biến đổi theo hướng bất lợi. Như vậy, TMSLH khụng gõy tổn thương rừ rệt cấu trỳc vi thể gan, thận của thỏ thực nghiệm.