2.3.1. Nghiờn cứu trờn thực nghiệm
2.3.1.1. Nghiờn cứu độc tớnh cấp
*Mục đớch: xỏc định cỏc dấu hiệu ngộ độc và xỏc định LD50 của thuốc “Thụng mạch sơ lạc hoàn” trờn chuột nhắt trắng bằng phương phỏp Litchfield – Wilcoxon.
*Cỏch tiến hành
- Trước khi tiến hành thớ nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đờm.
- Mười lụ chuột nhắt trắng, mỗi lụ mười con, được uống thuốc với liều tăng dần từ 76g dược liệu/kg đến 229g dược liệu/kg, với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,2ml/10g cõn nặng, uống ba lần/24 giờ, mỗi lần cỏch nhau hai giờ.
- Đường dựng: cho uống bằng cỏch bơm hỗn dịch vào thẳng dạ dày chuột. - Thời gian theo dừi: một tuần.
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ:
- Theo dừi tỡnh trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lụ trong 72 giờ. Sau đú tiếp tục theo dừi tỡnh trạng chung của chuột đến hết ngày thứ bảy sau khi uống chế phẩm thử.
- Quan sỏt cỏc hoạt động ăn uống và cỏc biểu hiện khỏc của chuột, ghi giờ xuất hiện cỏc triệu chứng bất thường, tỷ lệ chuột chết trong mỗi lụ. Nếu lụ nào cú chuột bị chết, mổ chuột kiểm tra đại thể đểđỏnh giỏ tỏc dụng gõy độc cấp đối với cơ quan chịu tỏc động chớnh của thuốc.
2.3.1.2. Nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn
*Mục đớch: thăm dũ độc tớnh liều nhắc lại ở thỏ khi cho uống thuốc liờn tục trong bốn tuần.
*Cỏch tiến hành
- Thỏđược chia thành ba lụ, mỗi lụ mười con, được nhốt riờng mỗi chuồng một con.
+ Lụ chứng cho uống nước cất, 5ml/kg/ngày.
+ Lụ trị 1: uống thuốc TMSLH 13,61 g/kg/ngày (tương đương với liều dựng cho người, tớnh theo hệ số 3).
+ Lụ trị 2: Uống thuốc TMSLH liều 40,82 g/kg/ngày (gấp ba lần liều ở lụ trị 1).
- Tất cả thỏ được uống nước cất và thuốc thử với thể tớch tương đương 5ml/kg/ngày, mỗi ngày một lần vào 8 giờ sỏng, liờn tục trong bốn tuần.
- Lấy mỏu lần đầu để xỏc định cỏc thụng số bỡnh thường của thỏ trước khi uống.
- Sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc: lấy mỏu thỏ để kiểm tra cỏc chỉ số sau thời gian uống thuốc.
- Sau khi ngừng thuốc hai tuần: lấy mỏu thỏ để kiểm tra cỏc chỉ số sau khi ngừng thuốc hai tuần.
- So sỏnh cỏc chỉ số sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc và sau khi ngừng thuốc hai tuần với cỏc chỉ số trước khi uống thuốc.
- Kết thỳc thớ nghiệm: mổ 30% thỏ ở lụ chứng và 30% thỏ ở lụ dựng thuốc ở thời điểm sau uống thuốc bốn tuần và sau ngừng thuốc hai tuần, quan sỏt đại thể và vi thể cỏc cơ quan như: gan, thận...
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ
- Tỡnh trạng chung (hoạt động, mắt, lụng, ăn uống, phõn...) và cõn nặng của thỏ.
- Đỏnh giỏ chức năng tạo mỏu thụng qua cỏc chỉ số: số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, cụng thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu. Cỏc chỉ số trờn được định lượng trờn mỏy xột nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hóng ABX - Diagnostic (Phỏp).
- Đỏnh giỏ chức năng gan thụng qua định lượng một số enzym và một số chất: AST, ALT, bilirubin toàn phần, protein toàn phần, cholesterol. Cỏc chỉ số trờn được định lượng trờn mỏy xột nghiệm húa sinh Screen master của hóng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Đỏnh giỏ chức năng thận bằng định lượng creatinin huyết thanh, được định lượng trờn mỏy xột nghiệm húa sinh Screen master của hóng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Mụ bệnh học: kiểm tra ngẫu nhiờn cấu trỳc đại thể và vi thể của gan và thận của 30% số thỏở mỗi lụ.
Xột nghiệm huyết học và sinh húa mỏu được thực hiện tại Bộ mụn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội.
Xột nghiệm đại thể, vi thể gan, thận... được thực hiện tại Bộ mụn Giải phẫu bệnh Trường Đại học Y Hà Nội.
2.3.1.3. Nghiờn cứu tỏc dụng trờn tim mạch của chế phẩm TMSLH * Nghiờn cứu tỏc dụng hạ huyết ỏp của chế phẩm TMSLH
- Chú được bộc lộ tĩnh mạch đựi và được gõy mờ bằng thiopental dung dịch 5% với liều 0,02 g/kg.
- Ghi huyết ỏp động mạch đựi qua huyết ỏp kế thủy ngõn. Hệ thống cột thủy ngõn được nối với thiết bị cảm ứng điện ADI đo huyết ỏp, điện tim, hụ hấp và nhiệt độ dựng riờng cho động vật.
- Kết quảđược hiển thị trờn một mỏy tớnh mắc nối tiếp. Thuốc thử được đưa theo đường uống liều 6,80 g/kg/ngày tương đương liều lõm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2).
- Theo dừi huyết ỏp: cỏc chỉ số HAtt, HAttr, HAtb, tần số tim... khi chưa uống thuốc thử và sau khi uống thuốc thử 30 phỳt/lần, liờn tục trong sỏu giờ.
Nghiờn cứu ảnh hưởng của TMSLH trờn huyết ỏp chú thụng qua hệ adrenergic và hệ cholinergic
Bước 1: theo dừi huyết ỏp bỡnh thường (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 2: tiờm adrenalin lần 1 liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ adrenergic hoặc tiờm acetylcholin lần 1
liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ cholinergic (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 3: uống TMSLH liều 6,80 g/kg/ngày tương đương liều lõm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2), theo dừi cỏc chỉ số huyết ỏp tại bốn thời điểm sau uống thuốc thử 30 phỳt, 60 phỳt, 90 phỳt và 120 phỳt (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 4: kết thỳc bước 3, tiờm adrenalin lần thứ hai liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ adrenergic hoặc tiờm acetylcholin lần thứ hai liều gấp mười lần so với lần thứ nhất (0,3 mg/kg đường tĩnh mạch) với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ cholinergic (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
* Nghiờn cứu tỏc dụng gión mạch của chế phẩm TMSLH
- Tai thỏđược cụ lập theo phương phỏp Kravkov.
- Cỏch pha dung dịch truyền: pha dung dịch TMSLH với liều 4,5ml; 9ml; 45ml; 90ml; 180ml/1000ml Ringer vừa đủ được dung dịch thuốc thử ở cỏc nồng độ 0,45%; 0,9%; 4,5%; 9%; 18%.
- Truyền dung dịch thuốc thửđó pha ởđộ cao 100 cm vào động mạch giữa. - Theo dừi số giọt dung dịch chảy ra ở hai tĩnh mạch vành tai trong một phỳt lỳc trước và sau khi dựng thuốc thử. Nếu số giọt chảy ra ở hai tĩnh mạch rỡa tai tăng chứng tỏ mạch gión hoặc ngược lại nếu số giọt giảm chứng tỏ mạch co.
2.3.2. Nghiờn cứu trờn lõm sàng
2.3.2.1. Thiết kế nghiờn cứu: theo phương phỏp thử nghiệm lõm sàng mự đơn, cú đối chứng giả dược.
2.3.2.2.Cỏch chọn mẫu
*Cỡ mẫu nghiờn cứu
Chọn 90 bệnh nhõn theo cỡ mẫu thuận tiện, chia làm hai nhúm mỗi nhúm 45 bệnh nhõn.
*Chiến lược chọn mẫu: bệnh nhõn phải đỏp ứng cỏc tiờu chuẩn khỏc về đối tượng nghiờn cứu nhưđó đề cập ở phần 2.2.2.
2.3.2.3. Quy trỡnh nghiờn cứu
*Cỏc bệnh nhõn đều được thăm khỏm lõm sàng, làm bệnh ỏn, làm cỏc xột nghiệm cận lõm sàng và điền đầy đủ cỏc mục của bệnh ỏn nghiờn cứu được xõy dựng theo mẫu thống nhất.
*Chia nhúm nghiờn cứu: 90 bệnh nhõn được chia vào hai nhúm nghiờn cứu và nhúm đối chứng đảm bảo sự tương đồng giữa hai nhúm về tuổi, giới và mức độ liệt. Trong đú:
- Nhúm đối chứng: dựng thuốc giả dược, XBBH và chếđộ tập luyện, vận động theo bài tập thống nhất được thầy thuốc hướng dẫn (Phụ lục 4a).
- Nhúm nghiờn cứu: dựng thuốc nghiờn cứu, XBBH và chế độ tập luyện, vận động theo bài tập thống nhất được thầy thuốc hướng dẫn (Phụ lục 4a).
*Quy trỡnh điều trị
- Nhúm đối chứng: gồm 45 bệnh nhõn được điều trị thuốc giả dược viờn 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần (sỏng, chiều) sau ăn 30 phỳt, với liệu trỡnh điều trị 30 ngày.
- Nhúm nghiờn cứu: gồm 45 bệnh nhõn dựng chế phẩm TMSLH uống viờn 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần (sỏng, chiều) sau ăn 30 phỳt, liờn tục trong 30 ngày.
Phỏc đồđiều trị nền ỏp dụng cho cả hai nhúm:
- Cỏc bệnh nhõn cú HAtt từ 140 đến 159mmHg và/hoặc HAttr từ 90 đến 99mmHg được dựng thuốc Natrilix SR 1,5mg x 1 viờn/ngày vào 8 giờ sỏng trong năm ngày đầu tham gia nghiờn cứu.
- Tất cả cỏc bệnh nhõn trờn đều được XBBH để phục hồi chức năng và cải thiện huyết ỏp ba lần/tuần, cỏch ngày một lần (do nhõn viờn y tế làm và hướng dẫn bệnh nhõn hoặc người nhà tự làm trong bốn ngày cũn lại trong tuần).
+ XBBH để phục hồi chức năng: bài tập lấy từ Bài giảng YHCT Đụng Y của Bộ mụn YHCT Trường Đại học Y Hà Nội [6]. Xin tham khảo phần “XBBH trong điều trị di chứng trỳng phong” (trang 26).
Liệu trỡnh: ba lần/tuần cỏch ngày một lần. Mỗi lần 45 phỳt.
+ XBBH để cải thiện huyết ỏp: bài tập lấy từ tài liệu giảng dạy Xoa búp của Bộ mụn Dưỡng sinh – Xoa búp thuộc Khoa YHCT Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chớ Minh [5]. Xin tham khảo phần “XBBH trong điều trị tăng huyết ỏp” (trang 27).
Liệu trỡnh: ba lần/tuần, cỏch ngày một lần. Mỗi lần 15 phỳt.
- Tất cả cỏc bệnh nhõn trờn đều được hướng dẫn chế độ ăn uống, sinh hoạt như sau: ăn giảm muối, giảm ăn chất bộo toàn phần và chất bộo bóo hoà, ăn thịt trắng, cỏ nạc, ăn nhiều rau xanh, quả tươi, ăn thức ăn dễ tiờu. Khụng ăn phủ tạng động vật, úc, trứng gà vịt, tụm cua chứa nhiều cholesterol, khụng uống rượu bia, khụng hỳt thuốc lỏ, trỏnh căng thẳng.
- Cỏc bệnh nhõn nhồi mỏu nóo sau giai đoạn cấp ở cỏc Khoa YHCT, Khoa Nội I, Khoa Hồi sức Cấp cứu thuộc Bệnh viện Đa khoa Xanh - Pụn đủ tiờu chuẩn theo YHHĐ và YHCT được tuyển chọn vào nghiờn cứu. Bệnh nhõn được theo dừi trong điều kiện nội trỳ và ngoại trỳ trong thời gian 30 ngày.
*Quy trỡnh theo dừi và đỏnh giỏ
- Theo dừi:
+ Cỏc chỉ số theo dừi:
• Cỏc chỉ sốđặc điểm chung, bệnh lý, huyết ỏp.
• Cỏc chỉ số lõm sàng liờn quan đến triệu chứng liệt nửa người:thang điểm Rankin, chỉ số Barthel, thang điểm Orgogozo
• Cỏc chỉ số cận lõm sàng:
Xột nghiệm huyết học (cụng thức mỏu, tỷ số APTT (Activated partial thromboplastin time), INR (International nornalised Ratio), fibrinogen).
Xột nghiệm húa sinh mỏu (urờ, glucose, creatinin, cholesterol, triglycerid, cholesterol HDL, cholesterol LDL, AST, ALT).
Chụp CLVT sọ nóo tại Khoa Chẩn đoỏn hỡnh ảnh Bệnh viện Đa khoa Xanh - Pụn (lỳc vào viện để chẩn đoỏn xỏc định).
• Tỏc dụng khụng mong muốn của thuốc nghiờn cứu. + Kỹ thuật đỏnh giỏ cỏc chỉ số:
• Huyết ỏp
Theo dừi chỉ số huyết ỏp: HAtt, HAttr, HAtb. Huyết ỏp được đo hàng ngày vào buổi sỏng, bệnh nhõn phải được nghỉ ngơi trước đú ớt nhất 15 phỳt, đo bằng huyết ỏp kếđồng hồ ALP K2 của Nhật bản. Huyết ỏp trung bỡnh = 3 tt ttr ΗΑ − ΗΑ + HAttr
Đỏnh giỏ phõn loại huyết ỏp theo JNC - VI (1997) [121].
Tiờu chuẩn đỏnh giỏ huyết ỏp: Theo phõn loại JNC - VI
Phõn loại huyết ỏp Huyết ỏp tõm thu (mmHg) Huyết ỏp tõm trương (mmHg) Tối ưu < 120 < 80 Bỡnh thường 120 – 129 80 – 84 Bỡnh thường cao 130 – 139 85 – 89 Độ 1 140 – 159 90 – 99 Độ 2 160 – 179 100 – 109 Tăng huyết ỏp Độ 3 ≥ 180 ≥ 110 • Thang điểm Rankin [129]
Thang điểm này được Rankin đề xuất từ năm 1957 nhằm lượng giỏ mức độ tổn thiệt (handicap) của bệnh nhõn sau cỏc trường hợp chấn thương, bệnh lý mạch mỏu, phẫu thuật, cỏc bệnh tật khỏc.
Nội dung và cỏch đỏnh giỏ như sau (Phụ lục 3a) Độ 1: Phục hồi hoàn toàn.
Độ 2: Di chứng nhẹ, tự sinh hoạt được.
Độ 3: Di chứng vừa, sinh hoạt cần người giỳp đỡ. Độ 4: Di chứng nặng, sinh hoạt cần phục vụ hoàn toàn. Độ 5: Di chứng rất nặng, cú nhiều biến chứng.
• Chỉ số Barthel [116]
Chỉ số này được đề xướng sử dụng trong lõm sàng từ 1965, để nhận định bệnh nhõn dựa vào khả năng hoạt động độc lập của họ về cỏc chức năng hàng ngày như: Khả năng độc lập hay phụ thuộc trong ăn uống, tựăn được hay cần trợ giỳp, cú khả năng bưng được bỏt cơm, cầm đũa hay khụng cầm được. Bệnh nhõn cú tự ngồi dậy, cú tự ngồi xe lăn, di chuyển từ xe lờn giường... Vệ sinh cỏ nhõn tại chỗ hay tự vào được nhà tắm, cụng việc đỏnh răng rửa mặt hàng ngày. Cú tự mặc quần ỏo hay phải trợ giỳp. Đi lại được trong phũng hoặc khụng đi lại được hay chỉ đứng được tại chỗ...
Bảng chỉ số Barthel cú tổng số mười tiờu chớ nhận định về chức năng sinh hoạt hàng ngày của bệnh nhõn với tổng sốđiểm là 100 (Phụ lục 3b).
Cỏch đỏnh giỏ: Dựa trờn kết quả cho điểm theo bảng chỉ số Barthel, bệnh nhõn được phõn làm bốn độ như sau:
Độc lập hoàn toàn: 76 đến 100 điểm (Độ I). Phụ thuộc một phần: 51 đến 75 điểm (Độ II). Phụ thuộc phần lớn: 26 đến 50 điểm (Độ III). Phụ thuộc hoàn toàn: 0 đến 25 điểm (Độ IV). • Thang điểm Orgogozo [124]
Là phương thức đỏnh giỏ trạng thỏi chức năng thần kinh của bệnh nhõn sau TBMN. Thang điểm này gồm mười mục kiểm tra dựa trờn quan sỏt và thăm khỏm chức năng cơ bản về ý thức, giao tiếp và vận động tứ chi.
Bảng thang điểm Orgogozo cú tổng số mười tiờu chớ nhận định về chức năng thần kinh, kiểm tra dựa trờn quan sỏt và thăm khỏm chức năng cơ bản về ý thức, giao tiếp và vận động tứ chi với tổng sốđiểm là 100 (Phụ lục 3c).
Cỏch đỏnh giỏ: dựa trờn kết quả cho điểm theo bảng thang điểm Orgogozo, bệnh nhõn được phõn làm bốn độ như sau:
Độ I (Tốt): 90 - 100 điểm. Độ II (Khỏ): 70 - 89 điểm.
Độ III (Trung bỡnh): 50 - 69 điểm. Độ IV (Kộm): < 50 điểm.
2.3.2.4. Tiờu chuẩn đỏnh giỏ kết quả, so sỏnh trước và sau điều trị
- Đỏnh giỏ kết quả theo YHHĐ: huyết ỏp, liệt thần kinh VII, chức năng ngụn ngữ, đỏnh giỏ phục hồi theo thang điểm Rankin, đỏnh giỏ mức độ liệt và sự phục hồi qua chỉ số Barthel và thang điểm Orgogozo.
- Cỏc chỉ số huyết học, húa sinh.
- Đỏnh giỏ kết quảđiều trị theo YHCT: hai thể TPKL và TPTP, thể hàn và thể nhiệt biến đổi theo thang điểm Rankin, Barthel và Orgogozo.
- Tỏc dụng khụng mong muốn của thuốc trờn lõm sàng
+ Cỏc chỉ tiờu theo dừi: nhức đầu, chúng mặt, rối loạn tiờu hoỏ, buồn nụn, nổi mềđay, cỏc triệu chứng khụng mong muốn khỏc.
+ Cỏch theo dừi: thống kờ cỏc loại và thời gian xuất hiện của cỏc tỏc dụng khụng mong muốn.
- Thời điểm theo dừi:
• Lõm sàng: cỏc bệnh nhõn nghiờn cứu đều được theo dừi ghi chộp hàng ngày và đỏnh giỏ đầy đủ cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu tại ba thời điểm như sau: ngày bắt đầu tiến hành nghiờn cứu (N0), sau 15 ngày điều trị (N15), sau 30 ngày điều trị (N30).
• Cận lõm sàng: cỏc chỉ số cận lõm sàng được đo lường vào thời điểm N0, N30 của quỏ trỡnh điều trị.
- Đỏnh giỏ kết quảđiều trị: + Cỏch đỏnh giỏ:
Đỏnh giỏ tiến triển độ liệt của bệnh nhõn trờn từng thang điểm Rankin, Barthel và Orgogozo (dựa vào sự dịch chuyển độ liệt) sau điều trị
Loại A: chuyển được hai độ liệt trở lờn. Loại B: chuyển lờn một độ liệt.
Loại C: khụng chuyển độ liệt hoặc nặng lờn.
Giỏ trị trung bỡnh chỉ số Barthel và Orgogozo trước và sau điều trị.
Đỏnh giỏ tỏc dụng khụng mong muốn trờn lõm sàng của bài thuốc nghiờn cứu: nhức đầu, chúng mặt, rối loạn tiờu hoỏ, buồn nụn, nổi mề đay, cỏc triệu chứng khụng mong muốn khỏc.
+ Thời gian đỏnh giỏ: so sỏnh cỏc thời điểm theo dừi của từng nhúm và