2.1.1. Thuốc nghiờn cứu
2.1.1.1. Thuốc dựng cho nghiờn cứu lõm sàng
* Thuốc Thụng mạch sơ lạc hoàn được bào chế tại Khoa YHCT, Bệnh viện Đa khoa Xanh - Pụn, đó đạt tiờu chuẩn kiểm định cơ sở (Phụ lục 2b).
- Cụng thức bài thuốc (trong một viờn hoàn 10g)
Sinh kỳ 5,0g Đan sõm 5,0g Địa long 1,67g Xuyờn khung 1,67g Ngưu tất 2,50g Sơn tra 3,33g Trần bỡ 1,67g Uất kim 2,50g
Cõu đằng 2,50g Phục linh 2,50g
- Cỏc vị thuốc được kiểm định theo tiờu chuẩn Dược điển Việt Nam IV [8]. - Quy trỡnh bào chế: (Phụ lục 2a).
- Tỏc dụng: bổ khớ, hoạt huyết, húa đàm, trấn kinh, thụng lạc.
- Liều dựng: viờn hoàn 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần (sỏng, chiều) sau ăn 30 phỳt.
* Thuốc hạ huyết ỏp Natrilix SR viờn nộn 1,5mg do Servier (Phỏp) sản xuất. Cỏch dựng: 1 viờn/ngày, uống vào 8 giờ sỏng, trong 5 ngày đầu [4].
2.1.1.2. Thuốc giả dược
Thuốc dựng trong nhúm đối chứng, được bào chế tại Khoa YHCT Bệnh viện Đa khoa Xanh - Pụn.
Thành phần chủ yếu là bột sắn (Pueraria thomsoni Benth) và tỏ dược, hoàn thành viờn cú trọng lượng, kớch thước và màu sắc giống hệt thuốc TMSLH và liều lượng sử dụng tương tự như TMSLH.
2.1.1.3. Thuốc dựng cho nghiờn cứu thực nghiệm
Thuốc dựng nghiờn cứu trờn thực nghiệm là thuốc TMSLH. Khi sử dụng trờn thực nghiệm cho động vật được hũa trong nước thành dạng cao lỏng. Cỏch làm như sau: 10 viờn hoàn (10g) hũa với 100ml nước sạch rồi đem đun và khuấy đều đến khi cũn 50ml.
2.1.2. Phương tiện và trang thiết bị nghiờn cứu
2.1.2.1. Phương tiện và trang thiết bị dựng trong nghiờn cứu thực nghiệm
- Dung dịch xột nghiệm mỏu ABX Minidil LMG của hóng ABX – Diagnostics, định lượng trờn mỏy Vet abcTM Animal Blood Counter.
- Kớt định lượng cỏc enzym và chất chuyển hoỏ trong mỏu: ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, protein, cholesterol và creatinin của hóng Hospitex Diagnostics (Italia) và hóng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trờn mỏy Screen master của hóng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Thiết bị ADI đo huyết ỏp, điện tim, hụ hấp và nhiệt độ dựng cho động vật của hóng Power Lab mó số ML840. Cột thủy ngõn số seri 29003 Model 2900 của Hóng Ugo Basille (Italia).
- Bộ dụng cụ tai thỏ cụ lập.
- Thuốc mờ thiopental lọ 1g của Đức, bột glucose, bột NaCl, bột KCl và cỏc húa chất khỏc... đủ tiờu chuẩn phũng thớ nghiệm Bộ mụn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội.
2.1.2.2. Phương tiện và trang thiết bị dựng trong nghiờn cứu lõm sàng
- Mỏy xột nghiệm huyết học tựđộng K - 4500 (Nhật Bản). Cỏc thuốc thử dựng để chuẩn mỏy do hóng Sysmex (Nhật Bản) sản xuất.
- Mỏy xột nghiệm sinh húa tự động Autolab Analyser (Đức) với kit của hóng Boehringer Mannheim.
- Mỏy chụp cắt lớp vi tớnh: Presto 4 dóy Hitachi (Nhật Bản).
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU 2.2.1. Đối tượng nghiờn cứu thực nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, 100 con, cả hai giống, sỏu tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
- Thỏ chủng Newzealand White, 40 con, cả hai giống, khoẻ mạnh, lụng trắng, nặng từ 1,8 đến 2,5kg do Trung tõm chăn nuụi, Viện Kiểm nghiệm Bộ Y tế cung cấp.
- Chú, 15 con, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 8 đến 12kg.
Động vật được nuụi trong điều kiện đầy đủ thức ăn bằng thức ăn chuẩn dành riờng cho từng loại động vật (do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Cụng ty liờn doanh Guyomarc’h - VCN sản xuất), uống nước tự do tại phũng thớ nghiệm Bộ mụn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội từ ba đến năm ngày trước khi nghiờn cứu và trong suốt thời gian nghiờn cứu.
2.2.2. Đối tượng nghiờn cứu lõm sàng
- Là những bệnh nhõn từ 18 tuổi trở lờn, khụng phõn biệt giới, nghề nghiệp, được chẩn đoỏn là NMN sau giai đoạn cấp được chuyển đến khỏm và điều trị tại Khoa YHCT Bệnh viện Đa khoa Xanh - Pụn.
- Bệnh nhõn bị NMN lần thứ nhất.
- Thời gian bị bệnh sau giai đoạn cấp từ 15 ngày đến 6 thỏng. - Bệnh nhõn đồng ý và tự nguyện tham gia nghiờn cứu.
2.2.2.1. Tiờu chuẩn chọn bệnh nhõn
* Tiờu chuẩn chẩn đoỏn theo Y học hiện đại
• Lõm sàng
- Bệnh nhõn được chẩn đoỏn xỏc định là NMN sau giai đoạn cấp [24], cũn liệt nửa người cỏc mức độ khỏc nhau, cú thể cú hoặc khụng cú liệt thần kinh VII, thất ngụn, rối loạn cơ trũn...
- Tỉnh tỏo, nghe và hiểu lời núi. Khụng cú cỏc biến chứng như: loột, bội nhiễm. - Đỏnh giỏ mức độ liệt: chọn bệnh nhõn cú di chứng từđộ 2 đến độ 4 theo độ liệt Rankin, cú chỉ số Barthel từ 0 đến 75 điểm (độ II đến độ IV), cú từ 0 đến 89 điểm (độ II đến độ IV) theo thang điểm Orgogozo [116], [124], [129].
- Huyết ỏp tõm thu dưới 160mmHg và huyết ỏp tõm trương dưới 100mmHg. - Cú hoặc khụng cú rối loạn lipid mỏu (nếu cú rối loạn thỡ ở mức cholesterol mỏu ≤ 6,5 mmol/l, triglycerid ≤ 2,3 mmol/l, LDL - cholesterol ≤ 3,7 mmol/l).
• Cận lõm sàng
- Cỏc xột nghiệm: huyết học, húa sinh.
- Phim chụp cắt lớp vi tớnh sọ nóo cú ổ giảm tỷ trọng, đõy là tiờu chuẩn để phõn biệt nhồi mỏu nóo với chảy mỏu nóo [12], [20], [34].
* Tiờu chuẩn chẩn đoỏn theo Y học cổ truyền [6], [9], [62]
Bệnh nhõn NMN sau giai đoạn cấp được tuyển chọn theo tiờu chuẩn YHHĐ, sau đú tiếp tục được phõn loại theo YHCT thụng qua tứ chẩn quy nạp bệnh vào cỏc chứng hậu [10], [35], [62]:
• Chẩn đoỏn thể bệnh YHCT theo thể TPKL - TPTP [10], [62]: ở giai đoạn hồi phục (thời gian mắc bệnh từ 15 ngày đến 6 thỏng), liệt nửa người, rối loạn ngụn ngữ, miệng mộo mắt xếch...
- Trỳng phong kinh lạc: lỳc phỏt bệnh ở giai đoạn cấp khụng cú hụn mờ. - Trỳng phong tạng phủ: lỳc phỏt bệnh ở giai đoạn cấp cú hụn mờ.
•Chẩn đoỏn thể bệnh YHCT theo thể hàn – thể nhiệt [62]
Tứ chẩn Thể hàn Thể nhiệt
Vọng Chất lưỡi nhợt, rờu trắng. Chất lưỡi đỏ, rờu vàng.
Văn Tiếng núi nhỏ. Tiếng núi to.
Vấn Đại tiện nỏt hoặc lỏng, nước tiểu trong. Đại tiện tỏo, nước tiểu vàng. Thiết Chõn tay lạnh, mạch trầm trỡ hoặc trầm hoón. Chõn tay ấm, mạch trầm sỏc hoặc trầm huyền hoạt. 2.2.2.2. Khụng nhận những bệnh nhõn sau
- Bệnh nhõn liệt nửa người khụng phải do nhồi mỏu nóo như: chảy mỏu nóo, chấn thương, u nóo, cú bệnh lý ở tim, dị dạng mạch mỏu nóo.
- Bệnh nhõn nhồi mỏu nóo tỏi phỏt lần hai trởđi.
- Huyết ỏp tõm thu bằng hoặc trờn 160mmHg, huyết ỏp tõm trương bằng hoặc trờn 100mmHg.
- Dịứng thuốc nghiờn cứu, bệnh lý về mỏu, sau mổ, sau đẻ, phụ nữ cú thai. - Bệnh nhõn NMN cú kốm theo cỏc bệnh: lao, rối loạn tõm thần, HIV/AIDS...
2.2.2.3. Tiờu chuẩn loại khỏi diện tổng kết nghiờn cứu
- Trong thời gian điều trị, phỏt hiện cỏc bệnh khỏc phải chữa trị (bệnh ảnh hưởng đến quỏ trỡnh nghiờn cứu).
- Bệnh nhõn khụng tuõn thủ yờu cầu nghiờn cứu như: uống thuốc khụng đủ liều, bỏ thuốc trong vũng ba ngày liờn tục, khụng làm đủ cỏc xột nghiệm theo yờu cầu nghiờn cứu, trong thời gian điều trị dựng kốm thuốc khỏc đểđiều trị NMN.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.3.1. Nghiờn cứu trờn thực nghiệm 2.3.1. Nghiờn cứu trờn thực nghiệm
2.3.1.1. Nghiờn cứu độc tớnh cấp
*Mục đớch: xỏc định cỏc dấu hiệu ngộ độc và xỏc định LD50 của thuốc “Thụng mạch sơ lạc hoàn” trờn chuột nhắt trắng bằng phương phỏp Litchfield – Wilcoxon.
*Cỏch tiến hành
- Trước khi tiến hành thớ nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đờm.
- Mười lụ chuột nhắt trắng, mỗi lụ mười con, được uống thuốc với liều tăng dần từ 76g dược liệu/kg đến 229g dược liệu/kg, với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,2ml/10g cõn nặng, uống ba lần/24 giờ, mỗi lần cỏch nhau hai giờ.
- Đường dựng: cho uống bằng cỏch bơm hỗn dịch vào thẳng dạ dày chuột. - Thời gian theo dừi: một tuần.
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ:
- Theo dừi tỡnh trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lụ trong 72 giờ. Sau đú tiếp tục theo dừi tỡnh trạng chung của chuột đến hết ngày thứ bảy sau khi uống chế phẩm thử.
- Quan sỏt cỏc hoạt động ăn uống và cỏc biểu hiện khỏc của chuột, ghi giờ xuất hiện cỏc triệu chứng bất thường, tỷ lệ chuột chết trong mỗi lụ. Nếu lụ nào cú chuột bị chết, mổ chuột kiểm tra đại thể đểđỏnh giỏ tỏc dụng gõy độc cấp đối với cơ quan chịu tỏc động chớnh của thuốc.
2.3.1.2. Nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn
*Mục đớch: thăm dũ độc tớnh liều nhắc lại ở thỏ khi cho uống thuốc liờn tục trong bốn tuần.
*Cỏch tiến hành
- Thỏđược chia thành ba lụ, mỗi lụ mười con, được nhốt riờng mỗi chuồng một con.
+ Lụ chứng cho uống nước cất, 5ml/kg/ngày.
+ Lụ trị 1: uống thuốc TMSLH 13,61 g/kg/ngày (tương đương với liều dựng cho người, tớnh theo hệ số 3).
+ Lụ trị 2: Uống thuốc TMSLH liều 40,82 g/kg/ngày (gấp ba lần liều ở lụ trị 1).
- Tất cả thỏ được uống nước cất và thuốc thử với thể tớch tương đương 5ml/kg/ngày, mỗi ngày một lần vào 8 giờ sỏng, liờn tục trong bốn tuần.
- Lấy mỏu lần đầu để xỏc định cỏc thụng số bỡnh thường của thỏ trước khi uống.
- Sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc: lấy mỏu thỏ để kiểm tra cỏc chỉ số sau thời gian uống thuốc.
- Sau khi ngừng thuốc hai tuần: lấy mỏu thỏ để kiểm tra cỏc chỉ số sau khi ngừng thuốc hai tuần.
- So sỏnh cỏc chỉ số sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc và sau khi ngừng thuốc hai tuần với cỏc chỉ số trước khi uống thuốc.
- Kết thỳc thớ nghiệm: mổ 30% thỏ ở lụ chứng và 30% thỏ ở lụ dựng thuốc ở thời điểm sau uống thuốc bốn tuần và sau ngừng thuốc hai tuần, quan sỏt đại thể và vi thể cỏc cơ quan như: gan, thận...
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ
- Tỡnh trạng chung (hoạt động, mắt, lụng, ăn uống, phõn...) và cõn nặng của thỏ.
- Đỏnh giỏ chức năng tạo mỏu thụng qua cỏc chỉ số: số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, cụng thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu. Cỏc chỉ số trờn được định lượng trờn mỏy xột nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hóng ABX - Diagnostic (Phỏp).
- Đỏnh giỏ chức năng gan thụng qua định lượng một số enzym và một số chất: AST, ALT, bilirubin toàn phần, protein toàn phần, cholesterol. Cỏc chỉ số trờn được định lượng trờn mỏy xột nghiệm húa sinh Screen master của hóng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Đỏnh giỏ chức năng thận bằng định lượng creatinin huyết thanh, được định lượng trờn mỏy xột nghiệm húa sinh Screen master của hóng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Mụ bệnh học: kiểm tra ngẫu nhiờn cấu trỳc đại thể và vi thể của gan và thận của 30% số thỏở mỗi lụ.
Xột nghiệm huyết học và sinh húa mỏu được thực hiện tại Bộ mụn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội.
Xột nghiệm đại thể, vi thể gan, thận... được thực hiện tại Bộ mụn Giải phẫu bệnh Trường Đại học Y Hà Nội.
2.3.1.3. Nghiờn cứu tỏc dụng trờn tim mạch của chế phẩm TMSLH * Nghiờn cứu tỏc dụng hạ huyết ỏp của chế phẩm TMSLH
- Chú được bộc lộ tĩnh mạch đựi và được gõy mờ bằng thiopental dung dịch 5% với liều 0,02 g/kg.
- Ghi huyết ỏp động mạch đựi qua huyết ỏp kế thủy ngõn. Hệ thống cột thủy ngõn được nối với thiết bị cảm ứng điện ADI đo huyết ỏp, điện tim, hụ hấp và nhiệt độ dựng riờng cho động vật.
- Kết quảđược hiển thị trờn một mỏy tớnh mắc nối tiếp. Thuốc thử được đưa theo đường uống liều 6,80 g/kg/ngày tương đương liều lõm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2).
- Theo dừi huyết ỏp: cỏc chỉ số HAtt, HAttr, HAtb, tần số tim... khi chưa uống thuốc thử và sau khi uống thuốc thử 30 phỳt/lần, liờn tục trong sỏu giờ.
Nghiờn cứu ảnh hưởng của TMSLH trờn huyết ỏp chú thụng qua hệ adrenergic và hệ cholinergic
Bước 1: theo dừi huyết ỏp bỡnh thường (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 2: tiờm adrenalin lần 1 liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ adrenergic hoặc tiờm acetylcholin lần 1
liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ cholinergic (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 3: uống TMSLH liều 6,80 g/kg/ngày tương đương liều lõm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2), theo dừi cỏc chỉ số huyết ỏp tại bốn thời điểm sau uống thuốc thử 30 phỳt, 60 phỳt, 90 phỳt và 120 phỳt (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 4: kết thỳc bước 3, tiờm adrenalin lần thứ hai liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ adrenergic hoặc tiờm acetylcholin lần thứ hai liều gấp mười lần so với lần thứ nhất (0,3 mg/kg đường tĩnh mạch) với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ cholinergic (ghi HAtt, HAttr, HAtb).
* Nghiờn cứu tỏc dụng gión mạch của chế phẩm TMSLH
- Tai thỏđược cụ lập theo phương phỏp Kravkov.
- Cỏch pha dung dịch truyền: pha dung dịch TMSLH với liều 4,5ml; 9ml; 45ml; 90ml; 180ml/1000ml Ringer vừa đủ được dung dịch thuốc thử ở cỏc nồng độ 0,45%; 0,9%; 4,5%; 9%; 18%.
- Truyền dung dịch thuốc thửđó pha ởđộ cao 100 cm vào động mạch giữa. - Theo dừi số giọt dung dịch chảy ra ở hai tĩnh mạch vành tai trong một phỳt lỳc trước và sau khi dựng thuốc thử. Nếu số giọt chảy ra ở hai tĩnh mạch rỡa tai tăng chứng tỏ mạch gión hoặc ngược lại nếu số giọt giảm chứng tỏ mạch co.
2.3.2. Nghiờn cứu trờn lõm sàng
2.3.2.1. Thiết kế nghiờn cứu: theo phương phỏp thử nghiệm lõm sàng mự đơn, cú đối chứng giả dược.
2.3.2.2.Cỏch chọn mẫu
*Cỡ mẫu nghiờn cứu
Chọn 90 bệnh nhõn theo cỡ mẫu thuận tiện, chia làm hai nhúm mỗi nhúm 45 bệnh nhõn.
*Chiến lược chọn mẫu: bệnh nhõn phải đỏp ứng cỏc tiờu chuẩn khỏc về đối tượng nghiờn cứu nhưđó đề cập ở phần 2.2.2.
2.3.2.3. Quy trỡnh nghiờn cứu
*Cỏc bệnh nhõn đều được thăm khỏm lõm sàng, làm bệnh ỏn, làm cỏc xột nghiệm cận lõm sàng và điền đầy đủ cỏc mục của bệnh ỏn nghiờn cứu được xõy dựng theo mẫu thống nhất.
*Chia nhúm nghiờn cứu: 90 bệnh nhõn được chia vào hai nhúm nghiờn cứu và nhúm đối chứng đảm bảo sự tương đồng giữa hai nhúm về tuổi, giới và mức độ liệt. Trong đú:
- Nhúm đối chứng: dựng thuốc giả dược, XBBH và chếđộ tập luyện, vận động theo bài tập thống nhất được thầy thuốc hướng dẫn (Phụ lục 4a).
- Nhúm nghiờn cứu: dựng thuốc nghiờn cứu, XBBH và chế độ tập luyện, vận động theo bài tập thống nhất được thầy thuốc hướng dẫn (Phụ lục 4a).
*Quy trỡnh điều trị
- Nhúm đối chứng: gồm 45 bệnh nhõn được điều trị thuốc giả dược viờn 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần (sỏng, chiều) sau ăn 30 phỳt, với liệu trỡnh điều trị 30 ngày.
- Nhúm nghiờn cứu: gồm 45 bệnh nhõn dựng chế phẩm TMSLH uống viờn 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần (sỏng, chiều) sau ăn 30 phỳt, liờn tục trong 30 ngày.
Phỏc đồđiều trị nền ỏp dụng cho cả hai nhúm:
- Cỏc bệnh nhõn cú HAtt từ 140 đến 159mmHg và/hoặc HAttr từ 90 đến 99mmHg được dựng thuốc Natrilix SR 1,5mg x 1 viờn/ngày vào 8 giờ sỏng trong năm ngày đầu tham gia nghiờn cứu.
- Tất cả cỏc bệnh nhõn trờn đều được XBBH để phục hồi chức năng và