2.2.6.Phương pháp ghép tế bào gốc trung mô tủy xương, tế bào đơn nhân tủy xương điều trị xơ hóa gan trên chuột
Sau 8 tuần gây độc bằng hóa chất CCl4 liều 0,8 ml/kg, những con chuột được đánh giá là bị xơ hóa gan được chọn để tiến hành thử nghiệm điều trị xơ hóa gan
trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp ghép tế bào (tiêm tĩnh mạch đuôi) vào ngày xử lý CCl4 liều cuối cùng. Chuột xơ hóa gan được chia thành 3 lô:
Lô CCl4 liều 0,8 ml/kg không được điều trị được sử dụng làm lô đối chứng
âm, tiêm tĩnh mạch đuôi 0,1 ml PBS/ con (lô CCl4-PBS).
Lô CCl4 liều 0,8 ml/kg được điều trị bằng phương pháp ghép (tiêm tĩnh mạch đuôi) 5x104 MSC/0,1ml/ con (lô CCl4-MSC).
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Lô CCl4 liều 0,8 ml/kg được điều trị bằng phương pháp ghép (tiêm tĩnh mạch đuôi) 5x104 BMC/0,1ml/ con (lô CCl4-BMC).
Cơ sở phương pháp [7] [12] [43] [56]
Xơ hóa gan là kết quả của sự mất cân bằng giữa tổng hợp và phân giải chất nền ngoại bào. Tế bào gốc trung mô được cho là có tác dụng điều hòa sự tổng hợp
và giáng hóa chất nền do tiết các cytokin và các yếu tố tăng trưởng (IL-10, TNF-α ,
yếu tố phát triển nội mô mạch-VEGF, yếu tố tăng trưởng tế bào gan-HGF, …) (Abdel Aziz và cộng sự, 2007). Cụ thể là MSC điều hòa sự biểu hiện enzym phân
hủy chất nền metalloproteinase góp phần vào giảm tiến triển xơ hóa (Xiang và cộng
sự). Cùng với khả năng ức chế tế bào hình sao hay nguyên bào sợi tổng hợp chất
nền ngoại bào (thông qua tác động giảm biểu hiện một số cytokin tiền viêm, là các yếu tố hoạt hóa tế bào hình sao tổng hợp chất nền ngoại bào) (Sivasami và cộng sự, 2010) và ức chế tế bào hình sao chuyển từ trạng thái ‘im lặng’ sang trạng thái hoạt hóa (thông qua tác động giảm sự biểu hiện thụ thể tế bào hình sao hoạt hóa -SMA) (Sivasami và cộng sự, 2010), ức chế tăng sinh tế bào hình sao (Zhao và cộng sự),
cảm ứng tế bào hình sao đã hoạt hóa đi vào apoptosis (Chen và cộng sự, 2002; Xu và cộng sự, 2005; Parekkadan và cộng sự, 2007). Tương tự, đã có nhiều tài liệu
công bố về khả năng giúp giảm xơ hóa gan của tế bào tủy xương chuột, ngăn chặn
sự hoạt hóa tế bào hình sao (thông qua sự giảm biểu hiện thụ thể -SMA) do đó
giảm tổng hợp collagen và ức chế sự biểu hiện của các cytokin gây viêm (TNF-, TGF-) (Miyazaki M và cộng sự, 2007; Cheuk-Kwan Sun và cộng sự, 2009).
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thử nghiệm dùng tế bào gốc trung mô tủy xương (MSC) để điều trị xơ hóa gan trên chuột. Song song đó tiến hành so sánh hiệu quả điều trị giữa tế bào gốc trung mô (MSC) với tế bào đơn nhân tủy xương
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ tủy xương để cấy ghép
Tế bào gốc trung mô được cấy ghép là tế bào được thu nhận từ quy trình 2.2.3.
và đã được khẳng định là tế bào gốc theo quy trình 2.2.4.
- MSC ở lần cấy chuyền 2 được tách khỏi bề mặt nuôi cấy bằng Trypsin/EDTA 0,25%. Bất hoạt trypsin bằng 3 ml môi trường nuôi cấy.
- Ly tâm thu nhận tế bào ở tốc độ 2500 vòng trong 5 phút.
- Rửa tế bào bằng 2 ml dung dịch PBS và ly tâm ở tốc độ 2500 vòng trong 5 phút. - Huyền phù tế bào trong 1ml dung dịch PBS và xác định tỷ lệ sống chết bằng phương pháp trypan blue.
- Điều chỉnh mật độ thích hợp 5 x 104 tế bào sống /0,1 ml trong PBS.
- Tiêm tế bào vào chuột thông qua đường tĩnh mạch đuôi.
Quy trình thu nhận quần thể tế bào đơn nhân từ tủy xương chuộtđể cấy ghép
Để thu nhận quần thể đơn nhân từ tủy xương, tương tự như quy trình thu nhận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MSC từ tủy xương chuột nhưng không qua nuôi cấy và có xử lý tế bào bằng dung
dịch ly giải hồng cầu. Quần thể tế bào đơn nhân từ tủy xương chuộtđược đánh giá
là đảm bảo yêu cầu khi tế bào không nhiễm vi khuẩn và nấm, dung dịch tế bào đã
được loại bỏ hoàn toàn tế bào hồng cầu.
- Giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ.
- Phẫu thuật thu nhận phần đùi và cẳng chân sau, loại bỏ phần lông bằng cách kéo ngược về hai phía (phía lên đầu và phía xuống chân).
- Bảo quản phần đùi và cẳng chân sau trong dung dịch PBS có chứa kháng sinh.
- Trong tủ cấy an toàn sinh học, sử dụng dụng cụ phẫu thuật loại bỏ phần cơ để thu
nhận phần xương có chứa tủy bên trong.
- Cắt bỏ đầu bao xương, sử dụng kim 27G chứa khoảng 10 ml PBS để dội rửa và thu nhận phần tủy xương (bằng cách bơm dịch từ đầu này sang đầu kia của xương).
- Ly tâm thu nhận tế bào ở tốc độ 2500 vòng trong 5 phút.
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
- Rửa tế bào bằng 2 ml dung dịch PBS và ly tâm ở tốc độ 2500 vòng trong 5 phút. - Huyền phù tế bào trong 1ml dung dịch PBS và xác định tỷ lệ sống chết bằng phương pháp trypan blue.
- Điều chỉnh mật độ thích hợp 5 x 104 tế bào sống /0,1 ml trong PBS.
- Tiêm tế bào vào chuột thông qua đường tĩnh mạch đuôi.
2.2.7.Phương pháp đánh giá hiệu quả điều trị xơ hóa gan của tế bào cấy ghép
Hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô tủy xương (MSC), tế bào đơn nhân
tủy xương (BMA) trên mô hình chuột xơ hóa gan được đánh giá cũng dựa trên các xét nghiệm sinh hóa hoạt độ ALT-AST trong huyết tương, nhuộm mô học
hematoxylin và eosin, sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (procollagen 1(I), integrin , ecto-5’-nucleotidase).
2.2.8.Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu hoạt độ ALT, AST được xử lý bằng phần mềm thống kê
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN
Phần I: KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH XƠ HÓA GAN CHUỘT BẰNG
HÓA CHẤT CCL4 0,8 ML/KG
3.1.Kết quả xét nghiệm sinh hóa: hoạt độ enzym alanine transaminase (ALT),
enzym aspartate transaminase (AST) trong huyết tương
Chuột được xử lý với hóa chất CCl4 liều 0,8 ml/kg trong thời gian 8 tuần, máu tĩnh mạch đuôi chuột được thu nhận ở các tuần 5 và 8 để đánh giá hiệu quả gây độc
gan của hoá chất thông qua xét nghiệm xác định hoạt độ ALT, AST trong huyết tương. Khi tế bào gan bị tổn thương, các enzym trong dịch bào (bao gồm các enzym transaminase) rò rỉ vào trong máu nên có thể đo lường ALT, AST để chỉ thị cho sự
hoại tử của tế bào. ALT tăng đáng kể trong viêm gan và tổn thương gan cấp tính. AST tương tự như ALT nhưng AST còn được tìm thấy ở các mô khác nên không (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đặc hiệu cho gan như ALT. Kết quả xét nghiệm ALT và AST được thể hiện trong
bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả hoạt độ ALT, AST sau 5 tuần, 8 tuần xử lý (2 lần/ tuần) với dầu bắp, CCl4 liều 0,8 ml/kg
ALT/ AST Đối chứng (dầu bắp) CCl4 liều 0,8 ml/kg
ALT tuần 5 (U/L) 80,1±6,0 110,3±26,9
AST tuần 5 (U/L) 48,8±21,2 139,0±26,8
ALT tuần 8 (U/L) 86,8±16,4 418,0±24,0
AST tuần 8 (U/L) 57,8±6,9 137,5±49,9
3.1.1.Hoạtđộ ALT-AST sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg
Sau 5 tuần chuột được xử lý với hóa chất CCl4 liều 0,8 ml/kg, hoạt độ ALT
trong huyết tương chuột uống CCl4 liều 0,8 ml/kg là 110,3±26,9 U/L tăng gấp 1,4
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận độ AST cũng được xác định sau khi thu nhận máu tĩnh mạch đuôi chuột đã bị xử lý
hóa chất gây độc sau 5 tuần (2 lần/ tuần). Hoạt độ AST trong huyết tương chuột uống CCl4 liều 0,8 ml/kg là 139,0±26,8 U/L cao gấp 2,9 lần so với hoạt độ AST ở nhóm đối chứng 48,8±21,2 U/L (bảng 1) và sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Kết quả ALT, AST sau 5 tuần xử lý chuột với hóa chất gây độc cho thấy rằng
CCl4 liều 0,8 ml/kg đã gây tổn thương tế bào gan làm giải phóng các enzym trong dịch bào (trong đó có các transaminase) vào trong máu làm hoạt độ ALT, AST
trong nhóm này tăng cao hơn so với nhóm đối chứng.
3.1.2.Hoạt độ ALT-AST sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg
Tác động gây tổn thương gan của hóa chất gây độc tiếp tục được theo dõi. Hoạt độ ALT, AST trong huyết tương cũng được đo lường, đánh giá sau 8 tuần xử
lý chuột với hóa chất gây độc. Kết quả ALT thu được như sau (bảng 1): hoạt độ
ALT trong huyết tương chuột uống dầu bắp là 86,8±16,4 U/L; hoạt độ ALT nhóm
xử lý CCl4 liều 0,8 ml/kg là 418,0±24,0 U/L cao gấp 4,8 lần so với nhóm đối chứng
và sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Đồng thời, cũng thu được kết
quả hoạt độ AST sau 8 tuần xử lý chuột với hóa chất CCl4 liều 0,8 ml/kg là 137,5±49,9 U/L có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với hoạt độ AST trong huyết tương chuột uống dầu bắp là 57,8±6,9 U/L.
Như vậy, dựa vào kết quả hoạt độ ALT, AST trong huyết tương chuột sau 8
tuần xử lý với hóa chất gây độc cho thấy CCl4 liều 0,8 ml/kg vẫn tiếp tục gây tổn thương tế bào gan, số lượng tế bào gan bị hoại tử ngày càng nhiều dẫn đến lượng
ALT, AST phóng thích vào máu càng cao.
Đối chiếu kết quả thu được trong đề tài với kết quả nghiên cứu ở chuột tiêm phúc mạc CCl4 1ml/kg (CCl4 được pha trong ôliu theo tỉ lệ 1: 1) trong 3 ngày xen kẽ của Sivasami Pulavendran và cộng sự (2010) cho thấy có sự tương đồng. Chuột
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
với nhóm đối chứng 125±13 U/L (ALT), 78±17 U/L (AST) (p<0,05). Kết quả trong đề tài cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả của Xiao-Xia Gengvà cộng sự (2005), M.T Abdel Aziz và cộng sự (2007).
3.1.3.So sánh hoạt độ ALT-AST giữa tuần 5 và tuần 8 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả xét nghiệm sinh hóa cho thấy hoạt độ ALT ở lô chuột uống CCl4 liều
0,8 ml/kg có xu hướng tăng cao từ tuần 5 đến tuần 8 (hoạt độ ALT ở tuần 8 là 418,0±24,0 U/L cao hơn nhiều so với tuần 5 là 110,3±26,9 U/L) và sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả này cho thấy mức độ gây tổn thương, hoại tử
tế bào gan của hóa chất ngày càng tăng theo thời gian từ tuần 5 đến tuần 8 (hình 3.1).
Tuy nhiên, hoạt độ AST ở tuần 8 hầu như không thay đổi so với tuần 5 (hoạt độ ALT ở tuần 8 là 137,5±49,9 U/L, tuần 5 là 139,0±26,8 U/L) (p>0,05) (hình 3.5). Kết quả này được giải thích thuộc một trong hai trường hợp sau: trường hợp thứ nhất AST cao bất thường ở tuần 5, trường hợp thứ hai AST thấp bất thường ở tuần
8. Nguyên nhân AST cao bất thường có thể là do như đã từng đề cập ở trên, AST không chỉ có ở gan mà còn hiện diện trong cơ xương, cơ tim, thận, não, phổi… nên
không đặc trưng cho gan bằng ALT (chủ yếu có ở tế bào gan, chỉ một lượng nhỏ ở
tế bào cơ, tim và thận). Do vậy, chuột bị tổn thương ở các cơ quan trên có thể làm
tăng lượng AST trong huyết thanh. Trong trường hợp hoạt độ AST thấp bất thường có thể do chưa tối ưu hóa điều kiện đểphản ứng xảy ra hoàn toàn. Dựa trên nguyên tắc đã nêu (trong chương 2, mục 2.2.2.1), hoạt độ ALT-AST đo được thông qua
mức độ giảm hấp thu của NADH khi bị khử thành NAD+ ở phản ứng (2). Nên AST
ở tuần 8 thấp có thể do nhiệt độ khi ủ hỗn hợp phản ứng không đúng 370C nên phản ứng (1) xảy ra chậm, hoặc do thời gian ủ chưa đủ để phản ứng (1) xảy ra hoàn toàn
nên khi tiến hành đo độ hấp thu, NADH chưa được chuyển hóa hết trong khoảng thời gian đo dẫn tới mức độ thay đổi độ hấp thu ít hơn. Do đó, hoạt độ enzym đo được thấp hơn trị số thật sự có trong huyết tương.
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
L-Aspartate + α-Ketoglutarate pyruvate + L-Glutamate (1)
Oxaloacetate + NADH L-Malate + NAD+ (2)
Tóm lại, các kết quả cho thấy ở cả tuần 5 và 8, hoạt độ enzym ALT-AST của lô gây độc cao hơn so với lô đối chứng (cho uống dầu bắp). Như vậy, hóa chất CCl4
có tác dụng gây tổn thương hoặc/ và hoại tử tế bào làm cho các enzym ALT-AST rò rỉ vào trong máu dẫn đến tăng hàm lượng các enzym này trong huyết tương.
Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện hoạt độ ALT trong huyết tương chuột sau 5 tuần, 8 tuần uống dầu bắp (đối chứng), CCl4 liều 0,8 ml/kg, 2 lần/ tuần.
AST
MDH
Hoạt độ ALT (U/L)
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hoạt độ AST trong huyết tương chuột sau 5 tuần/ 8 tuần uống dầu bắp (đối chứng), CCl4 liều 0,8 ml/kg, 2 lần/ tuần.
Kết quả xét nghiệm sinh hóa cũng thể hiện hoạt độ các enzym ALT, AST ở nhóm đối chứng không thay đổi theo thời gian (từ tuần 5-8) (p>0,05). Như vậy dựa vào kết quả này có thể bước đầu khẳng định dầu bắp không làm tổn thương đến tế
bào gan.
3.2.Kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin
Song song với việc đánh giá tác động gây độc của CCl4 liều 0,8 ml/kg thông qua hoạt độ ALT, AST; tác động lên sự thay đổi mô học của hóa chất cũng được
theo dõi. Gan chuột được sinh thiết, sau đó được nhuộm mô học hematoxylin và eosin, đánh giá sự hoại tử và mức độ xơ hóagây bởi hóa chất ở tuần 5 và tuần 8.
Hoạt độ AST (U/L)
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
3.2.1.Kết quả mô học sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Về cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (hình 3.3) có màu đỏ tươi, các thùy gan có kích thước bình thường, bề mặt gan nhẵn bóng.
Hình 3.3. Cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 5 tuần cho uống dầu bắp 2 lần/ tuần).
Kết quả nhuộm hematoxylin và eosin (hình 3.4) cho thấy cấu trúc vi thể gan
với bề gan một lớp, tế bào gan bình thường, có thoái hóa mỡ gan ở mức độ nhẹ (sự
thoái hóa mỡ ở mức độ nhẹ có thể là do dinh dưỡng kém, chuột được cho uống dầu
bắp biếng ăn), có sự xâm nhập bạch cầu đơn nhân.
X400
Hình 3.4. Cấu trúc vi thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (sau 5 tuần cho uống dầu bắp 2 lần/ tuần) (kết quả nhuộm H&E).
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận Trong khi đó cấu trúc đại thể gan chuột được cho uống CCl4 liều 0,8 ml/kg
trong thời gian 5 tuần có sự khác biệt so với nhóm đối chứng cả về màu sắc lẫn hình
thái. Gan màu sậm vàng, bề mặt gan xuất hiện nốt nhỏ li ti trông thô nhám, mất độ nhẵn bóng (hình 3.5).
Hình 3.5. Cấu trúc đại thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg.
Để đi sâu vào tác động của hóa chất trên cấu trúc mô gan, gan chuột được sinh thiết và nhuộm hematoxylin và eosin. Kết quả thu được như sau (hình 3.6): cấu trúc gan một lớp, có sự thâm nhập của bạch cầu ở khoảng cửa, gan viêm nhẹ, các tế bào gan với nhân hoạt động, nghịch sản tế bào gan ở mức độ nhẹ. Như vậy CCl4 liều 0,8 ml/kg đã gây tác động tổn thương gan, các tế bào gan đáp ứng lại bằng cách tăng sản để bù đắp cho số lượng và chức năng của những tế bào tổn thương. Tuy
nhiên, sự tăng sản bất thường nên xuất hiện những tế bào với nhân hoạt động,
nhiễm sắc thể tháo xoắn nhưng tế bào không thể phân chia (nghịch sản).
X400
Hình 3.6. Cấu trúc vi thể gan chuột sau 5 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg (kết quả nhuộm H&E).
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
3.2.2.Kết quả mô học sau 8 tuần xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg
Tác động lên sự thay đổi mô học của hóa chất gây độctiếp tục được đánh giá ở tuần thứ 8.
Về cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng (hình 3.7) có màu đỏ