Adenosin là một chất điều hòa nội sinh trong mô tổn thương, được giải phóng từ
các tế bào tổn thương và mô. Xơ hóa gan là kết quả từ tổn thương gan mạn tính.
Zhongsheng Peng và cộng sựđã công bố adenosin nội sinh, hoạt động trên thụ thể
A2A đóng một vai trò trong xơ hóa gan do chất độc. Adenosin được hình thành bên trong tế bào và sau đó được vận chuyển vào khoảng ngoại bào hay có thể được hình thành từ adenin ngoại bào giải phóng từ các tế bào tổn thương. Do ecto-5’- nucleotidase (CD73) xúc tác phản ứng cuối để hình thành adenosin ngoại bào từ
AMP, Zhongsheng Peng và cộng sự đã chứng minh ecto-5’-nucleotidase đóng một
vai trò quan trọngtrong sự phát triển xơ hóa gan.
Để kiểm tra sự hiện diện của ecto-5’-nucleotidase trong mô gan bị xử lý chất
CCl4 liều 0,8 ml/kg, RNA tổng số tách chiết được khuyếch đại với mồi đặc trưng
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
3.16), trong khi vạch GAPDH xuất hiện như nhau ở cả hai nhóm đối chứng và nhóm CCl4 liều 0,8 ml/kg, thì đối với vạch 220bp đặc trưng cho sự hiện diện ecto- 5’-nucleotidase lại thể hiện khác biệt ở hai nhóm. Ở nhóm đối chứng không thấy sự
hiện diện ecto-5’-nucleotidase ở 220bp, nhưng vạch này lại xuất hiện rất rõ ở nhóm được cho uống CCl4 0,8 ml/kg.
Hình 3.16. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuyếch đại RT-PCR ecto-5’- nucleotidase, GAPDH.
Giếng 1L: thang chuẩn 100-1000bp, giếng 2N: ecto-5’-nucleotidase ở chuột nhóm đối chứng, giếng
3N: ecto-5’-nucleotidase ở chuột nhóm CCl4 0,8 ml/kg, giếng 4G: GAPDH ởchuột nhóm đối chứng, giếng 5G: GAPDH ở chuột nhóm CCl4 0,8 ml/kg.
Các kết quả này có thể được giải thích như sau: dưới tác động của cytokin gây viêm được giải phóng từ mô gan tổn thương cùng với một số yếu tố khác chưa được
biết tác động lên sự biểu hiện của ecto-5’-nucleotidase, cụ thể là biểu hiện tăng mức
khi bị xử lý với CCl4 liều 0,8 ml/kg. Sự tăng tổng hợp ecto-5’-nucleotidase dẫn đến
kết quả tất yếu tăng mức adenosin ngoại bào do ecto-5’-nucleotidase xúc tác phản ứng tổng hợp adenosin (theo Zimmermann, 2000; Cláudia M.B. và cộng sự, 2008;
Zhongsheng Peng 2008; Majid Katebi và cộng sự, 2009). Sự tăng adenosin trong
mô gan tổn thương hoạt hóa tế bào hình sao qua thụ thể A2A tăng tổng hợp và biểu
hiện collagen theo con đường tín hiệu có liên quan tới Protein Kinase A, Src, và erk
½ hay qua con đường tín hiệu p38 MAPK (Jiantu Che và cộng sự, 2007), cuối cùng dẫn đến xơ hóa gan. Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại RT-PCR của ecto-5’- nucleotidase cùng với kết quả procollagen 1(I) đều tăng ở nhóm CCl4 liều 0,8
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Hình 3.17. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm khuếch đại RT-PCR procollagen α1(I), ecto-5’-nucleotidase, GAPDH.
Giếng 1L: thang chuẩn 100-1000bp, giếng 2P: procollagen α1(I) ở chuột nhóm đối chứng, giếng 3P: procollagen α1(I) ở chuột nhóm CCl4 0,8 ml/kg, giếng 4N: ecto-5’-nucleotidase ở chuột nhóm
đối chứng, giếng 5N: ecto-5’-nucleotidase ở chuột nhóm CCl4 0,8 ml/kg, giếng 6G: GAPDH ở chuột nhóm đối chứng, giếng 7G: GAPDH ở chuột nhóm CCl4 0,8 ml/kg.
Tiến hành so sánh kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin kết hợp với
kết quả điện di biểu hiện procollagen 1(I) và ecto-5’-nucleotidase với kết quả
nghiên cứu của Zhongsheng Peng và cộng sự 2008 về mối tương quan giữa sự biểu
hiện collagen với ecto-5’-nucleotidase. Kết quả nhuộm hematoxylin và eosin của
Zhongsheng Peng 2008 cho thấy chuột bị knock down gen mã hóa cho CD73 khi bị xử lý với CCl4 (CD73KO-CCl4) được bảo vệ khỏi xơ hoá với lượng collagen ít hơn đáng kể so với chủng chuột hoang dại bị xử lý CCl4 (WT-CCl4). Như vậy sự ức chế tổng hợp adenosin hay khóa thụ thể adenosin có thể giúp ngăn xơ hóa ở chuột (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CD73KO. Sự tổng hợp adenosin ngoại bào được trung gian bởi ecto-5’-nucleotidase (CD73) đóng một vai trò quan trọng trong xơ hóa gan. Tuy sử dụng phương pháp
nghiên cứu khác so với Zhongsheng Peng (2008), nhưng kết quả thu được trong đề
tài cho thấy có sự nhất quán trong hai nghiên cứu đó là tăng mức biểu hiện ecto-5’- nucleotidase (kết quả điện di sản phẩm ecto-5’-nucleotidase) cùng với sự tăng tổng
hợp và biểu hiện collagen (nhuộm hematoxylin và eosin, kết quả điện di sản phẩm
procollagen 1(I)) ở gan chuột uống CCl4 liều 0,8 ml/kg là đặc tính tăng sinh bù trừ của tế bào trong gan, các tế bào hoại tử tiết ra các tín hiệu gây phản ứng viêm, từ đó
hoạt hóa tế bào hình sao gây sự tích tụ quá mức của chất nền ngoại bào. Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn, cuối cùng sự tái sinh của gan không đủ để phục hồi, các tế
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
bào gan sẽ bị thay thế dần bởi lượng lớn chất nền ngoại bào, khi đó gan đã bị xơ
hóa.
Hình 3.18. Mối liên hệ giữa sự biểu hiện CD73 với sự phát sinh xơ hóa gan (kết quả nhuộm H&E).
Cấu trúc vi thể gan của chuột WT-ĐC (hoang dại); chuột KOCD73-ĐC (bị knock down gen mã hóa cho CD73) được tiêm PBS làm đối chứng và chuột ĐCđược cho uống dầu bắp làm đối chứng. Cấu trúc vi thể gan của chuột WT-CCl4 (hoang dại); chuột KOCD73-CCl4 (bị knock down gen mã hóa cho CD73) được tiêm 0,1ml CCl4 (pha trong dầu tỉ lệ 1:3) và chuột CCl4 được cho uống CCl4
liều 0,8 ml/kg.
Kết luận chung cho kết quả xây dựng mô hình xơ hóa gan như sau:
Sau 8 tuần xử lý với hóa chất CCl4 liều 0,8 ml/kg, mô hình xơ hóa gan trên chuột nhắt trắng đã được xây dựng thành công. Chuột bị xơ gan bởi CCl4 liều 0,8
ml/kg có hoạt độ ALT, AST tăng cao so với nhóm đối chứng (uống dầu bắp 2 lần/
tuần) (p < 0.05); cấu trúc gan chuột có những tế bào phồng to, thoái hóa mỡ, teo
nhân, có sự tăng sản tế bào gan bất thường, có sự tăng sinh tế bào sợi từ khoảng cửa đi vào trong các tiểu thùy, có dạng bắt cầu sợi giữa các vùng hoại tử tạo nhiều tiểu
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận hematoxylin và eosin được khẳng định lần nữa bằng kết quả tăng biểu hiện ở mức độ phiên mã của gen mã hóa cho thành phần chất nền ngoại bào procollagen 1(I), là kết quả tất yếu của sự tăng biểu hiện tế bào sinh xơ hóa (intergrin). Một trong
những yếu tố hoạt hóa tế bào trong gan tăng tổng hợp và biểu hiện các chất nền
ngoại bào đó là adenosin (được tổng hợp nhờ enzym ecto-5’-nucleoxidase) theo con
đường tín hiệu có liên quan tới Protein Kinase A, Src, và erk ½, p38 MAPK (Jiantu Che và cộng sự, 2007), cuối cùng là dẫn đến xơ hóa gan.
Tóm lại, các kết quả nghiên cứu cho thấy có sự phù hợp giữa chỉ số sinh hóa,
đặc điểm mô học, và sự biểu hiện gen mức phiên mã với đặc điểm tái sinh bù trừ
của gan khi bị tổn thương. Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn, cuối cùng sự tái sinh
của gan không đủ để phục hồi, các tế bào gan sẽ bị thay thế dần bởi lượng lớn chất
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Phần II: KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
TỦY XƯƠNG CHUỘT
3.4.Kết quả thu nhận tế bào gốc trung mô ứng viên
Tủy xương từ chuột được thu nhận và nuôi trong bình nuôi cấy 25 cm2 với môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và kháng sinh. Ngay sau khi thu nhận tế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bào từ tủy xương, các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi và có thể nhận thấy
các tế bào hồng cầu hình đĩa, lõm hai mặt và một số lượng lớn các tế bào có nhân hình tròn đều(hình 3.19).
X100
Hình 3.19. (a) Tế bào vừa thu nhận từ tủy xương, (b) Quần thể tế bào sau 24 giờ nuôi cấy.
Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào gốc trung mô (MSC) ứng viên vẫn có hình cầu và có hiện tượng bám trên bề mặt bình nuôi, trong khi các tế bào khác vẫn trôi lơ lửng
trong dịch huyền phù tế bào (hình 3.19).
Sau 48 giờ nuôi cấy, môi trường mới được bổ sung nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho sự phát triển của MSC ứng viên đã bám vào bình nuôi. Ngoài ra, việc
thay môi trường đồng thời cũng giúp loại bỏ những tế bào chết cũng như các tế bào máu còn lơ lửng trong môi trường cũ. Sau 72 giờ, tế bào gốc trung mô ứng viên bắt đầu trải ra trên bề mặt bình nuôi, khi đó tế bào gốc trung mô ứng viên đã có hình dạng đặc trưng, thường là hình thoi (giống với nguyên bào sợi) (hình 3.20).
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
X100
Hình 3.20. (a) Quần thể tế bào sau 48 giờ nuôi cấy, (b) Quần thể tế bào sau 72 giờ nuôi cấy.
Hình dạng tế bào được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược có dạng hình thoi khi mới bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy. Sau đó, tế bào trải ra bề mặt nuôi cấy với
hình dạng chủ yếu là các hình đa giác, dạng con suốt, kéo dài. Khi mật độ tế bào bao phủ toàn bộ bề mặt nuôi cấy thì hầunhư chỉ còn các tế bào dạng đa giác. Các tế
bào này không chồng lấp lên nhau mà trải khắp bề mặt bình nuôi cấy với một lớp đơn. Tại một số vị trí, các tế bào dạng cầu bám vào bề mặt nuôi cấy một thời gian
ngắn rồi nổi lên và chết sau các lần thay môi trường. Những tế bào còn sống tiếp tục
trải ra, lấp đầy phần trống trên đĩa nuôi. Hình dạng cũng như cách tăng sinh và bám
dính của các tế bào phân lập từ tủy xương chuột so với những đề tài nghiên cứu
khác không có sự khác biệt.
X40
Hình 3.21. (a) Quần thể tế bào sau 8 ngày nuôi cấy, (b) Quần thể tế bào sau 15 ngày nuôi cấy.
Từ ngày nuôi cấy 4-8, MSC ứng viên tăng sinh mạnh và đạt 65-70% diện tích
bình nuôi trong 2 tuần nuôi cấy (hình 3.21). Vào thời điểm này, việc cấy chuyền
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
thiết. Các tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi được cấy chuyền và pha loãng theo tỷ lệ 1:3, nghĩa là từ một bình nuôi cấy sơ cấp sẽ cấy thành 3 bình mới.
X100
Hình 3.22. (a) Tế bào sau cấy chuyền 5 ngày, (b) Tế bào sau cấy chuyền 7 ngày.
Các tế bào sau lần cấy chuyền thứ nhất có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn so với
các tế bào lúc mới nuôi cấy, sau một tuần các tế bào sẽ đạt mật độ 70-80% diện tích
bề mặt nuôi cấy, hình dạng các tế bào tương đối đồng nhất, hình dạng giống nguyên bào sợi.
Khi cấy chuyền ở mật độ thưa để khảo sát khả năng hình thành tập đoàn (colony), kết quả cho thấy MSC ứng viên có khả năng hình thành tập đoàn (hình 3.23). Kết quả này chứng tỏ khả năng tăng sinh và phát triển mạnh của các MSC ứng viên từ tủy xương. Tóm lại, các MSC ứng viên được thu nhận trong nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
này: 1. về hình dạng khi bám trải: chúng có hình thoi giống với nguyên bào sợi; 2.
về khả năng hình thành tập đoàn: các MSC ứng viên có khả năng hình thành tập
đoàn khi được nuôi cấy ở mật độ thấp. Kết quả này khi so sánh với nhóm tác giả
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Hình 3.23. Một số kiểu hình tập đoàn của MSC ứng viên khi nuôi cấy ở mật độ thấp.