xương chuột
Nguyên tắc [4] [36] [49] [55]
Trong tủy xương, các quần thể tế bào có thể thu nhận được là: 1. Tế bào hồng
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp trưởng thành); 3. Tế bào nền tủy xương; 4. Tế bào mỡ; 5. Tế bào gốc. Trong các
quần thể tế bào trên, quần thể hồng cầu, bạch cầu trưởng thành và tế bào mỡ là không có khả năng bám vào bề mặt nuôi cấy hoặc chỉ trong thời gian ngắn. Vì vậy, trong điều kiện nuôi cấy bám dính, các tế bào này sẽ bị loại bỏ sau các lần thay môi trường. Tế bào bạch cầu chưa trưởng thành, một số tế bào nền tủy xương có khả năng bám dính chọn lọc, tuy nhiên điều kiện môi trường nuôi cấy không thích hợp nên đời sống của các tế bào này rất ngắn.
Quần thể tế bào gốc chứa 2 loại chính: tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung
mô (Pittenger và cộng sự 1999), trong 2 loại này chỉ có tế bào gốc trung mô là có khả năng bám dính và tăng sinh vô hạn trong điều kiện in vitro.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chọn lọc tế bào gốc trung mô từ tủy xương theo phương pháp của Nadri, S. et al (2007), kết hợp với một số biến đổi của
nhóm tác giả Masoud Soleimani & Samad Nadri (2009).
Quy trình tiến hành
- Giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ.
- Phẫu thuật thu nhận phần đùi và cẳng chân sau, loại bỏ phần lông bằng cách kéo ngược về 2 phía (phía lên đầu và phía xuống chân).
- Bảo quản phần đùi và cẳng chân sau trong dung dịch PBS có chứa kháng sinh.
- Trong tủ cấy an toàn sinh học, sử dụng dụng cụ phẫu thuật loại bỏ phần cơ để thu
nhận phần xương có chứa tủy bên trong.
- Cắt bỏ đầu bao xương, sử dụng kim 27G chứa khoảng10 ml môi trường nuôi cấy để dội rửa và thu nhận phần tủy xương (bằng cách bơm dịch từ đầu này sang đầu
kia của xương).
- Huyền phù đếu dịch thu được để tránh các tế bào bị vón thành cụm.
- Nuôi tế bào tủy xương ở mật độ 25 x 106 tế bào/ml trong bình nuôi 25cm2. - Đặt các bình nuôi ở nhiệt độ 370C và 5% CO2 trong tủ ấm nuôi tế bào.
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
- Sau thời gian từ 3-24 giờ (khi có các tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy), tiến hành thay bỏ môi trường cũ và bổ sung môi trường nuôi cấy mới.
- Thay môi trường mỗi 3-4 ngày đến khi có các tế bào có hình dạng như nguyên
bào sợi (hình thoi).
- Sau 2 tuần, tế bào có thể đạt mật độ 65%-70%, tiến hành cấy chuyền bằng 0,5ml
trypsin 0,25%. Nuôi tế bào trong bình nuôi mới với mật độ 1x105 tế bào/bình nuôi.
Hình 2.12. Thao tác thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương chuột.
(a) Kéo giãn đốt sống cổ chuột, (b) Thu nhận đùi sau của chuột, (c) Bảo quản mẫu trong PBS có
kháng sinh, (d) Loại bỏ phần cơ quanh đùi chuột, (e) Dội rửa và thu nhận tế bào trong tủy xương, (f) Nuôi tế bào trong bình roux 25 cm2sau khi đã huyền phù đều.
Đánh giá kết quả
Các tế bào đảm bảo yêu cầu (không nhiễm vi khuẩn và nấm, tế bào bám có hình dạng tương tự nguyên bào sợi) được xem là các tế bào gốc trung mô ứng viên và được kiểm tra, đánh giá để khẳng định là tế bào gốc trung mô.
2.2.4.Phương pháp khẳng định tế bào gốc ứng viên là tế bào gốc trung mô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên tắc [36] [55]
Dựa vào khả năng bám dính của MSC vào bề mặt nuôi cấy, sau từ 3-5 lần cấy
chuyền sẽ thu được quần thể tế bào tương đối đồng nhất. Thông thường để khẳng định tế bào gốc chuột ứng viên là MSC dựa vào các chỉ tiêu sau:
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
- Về hình thái tế bào: các tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi khi bám dính
vào bề mặt dụng cụ nuôi cấy.
- Về marker bề mặt: các MSC từ tủy xương chuột dương tính với CD44, Sca-1 và
CD90 trong khi đó lại âm tính với CD34, CD11b, CD31, CD106 (Vcam-1), CD117 (c-kit) và CD135 (Samad nadri và cộng sự, 2007; Masoud và cộng sự, 2009).
- Về khả năng biệt hóa: các MSC từ tủy xương chuột có khả năng biệt hóa thành
xương, sụn và mỡ. Trong nghiên cứu này, các MSC từ tủy xương chuột được đánh
giá dựa vào tất cả các đặc điểm trên. Về mặt hình thái tế bào, sử dụng kính hiển vi để quan sát hình dạng các tế bào trong suốt thời gian nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp.
Marker tế bào được đánh giá bằng kỹ thuật Flow cytometry. Khả năng biệt hóa được đánh giá thông qua khả năng biệt hóa của MSC thành 2 dạng tế bào: xương và
mỡ.
2.2.4.1.Phương pháp xác định marker bằng Flow cytometer Nguyên tắc
Flow cytometry là một công cụ khá hữu dụng để xác định kiểu hình và đặc
tính của tế bào dựa trên đặc điểm về tán xạ ánh sáng và các tín hiệu huỳnh quang
của tế bào. Tín hiệu huỳnh quang có mối liên quan đến loại thuốc nhuộm sử dụng
hoặc đặc điểm của kháng thể đơn dòng đối với các phân tử trên bề mặt tế bào hay những thành phần bên trong của tế bào. Do đó có thể xác định các loại tế bào khác nhau bằng phương pháp này.
Quy trình phân tích Flow cytometry
Trong nghiên cứu này, việc đánh giá marker của MSC sau nuôi cấy được tiến
hành dựa theo quy trình chuẩn bị tế bào để phân tích Flow cytometry (theo hướng
dẫn của BD Science) và các tế bào ở lần cấy chuyền 2-4 được chọn để phân tích marker đặc trưng cho MSC.
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
- Các tế bào nuôi cấy bám dính được tách khỏi bề mặt nuôi cấy bằng enzym
Trypsin/EDTA 0,25% (Sigma).
- Chuyển phần tế bào vào ống ly tâm 15ml, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng trong 5 phút
để thu nhận phần tế bào.
- Rửa tế bào bằng dung dịch PBS pH 7,4 bổ sung 1% BSA, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng trong 5 phút để thu nhận phần tế bào.
- Huyền phù tế bào ở mật độ 1x106 tế bào/ml trong dung dịch PBS/BSA.
- Bổ sung kháng thể (có gắn với hạt huỳnh quang (Flourochrome) thích hợp) ở độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pha loãng thích hợp theo hướng dẫn Nhà sản xuất, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Ủ mẫu tế bào sau khi nhuộm kháng thể ở 40C trong 15 phút để làm lạnh mẫu trước khi phân tích.
- Phân tích mẫu bằng máy Flow cytometer và sử dụng phần mềm Cell Quest pro để phân tích kết quả.
Đánh giá kết quả
Phân tích mẫu bằng máy Flow cytometer và sử dụng phần mềm Cell Quest pro để phân tích kết quả.
2.2.4.2.Phương pháp biệt hóa
a. Biệt hóa thành nguyên bào xương
Nguyên tắc
Sự biệt hóa thành xương được xác định là trạng thái biệt hóa cuối cùng của các
dòng MSC. MSC trong môi trường nuôi cấy, sau khi tiếp xúc với dexamethasone, AsAP và beta-glycerolphosphate có thể được cảm ứng thành tế bào tạo xương, thể
hiện sự tích tụ calcium trong chất nền và biểu hiện các marker tạo xương như sialoprotein xương osteocalcin và osteonectic. Các tế bào tạo xương được phát hiện
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Quy trình biệt hóa thành xương [4] [55]
Quy trình biệt hóa MSC thành xương được tiến hành theo quy trình của Nadri, S. và cộng sự (2007), Phạm Văn Phúc và cộng sự (2009).
- Sử dụng môi trường biệt hóa xương (phụ lục 1.1)để nuôi cấy tế bào. - Trải tế bào khoảng 10,000 tế bào/cm2 trong lớp đơn.
- Nuôi cấy lớp đơn trong khoảng 14-21 ngày. - Thay môi trường biệt hóa xương 2 lần/tuần.
Đánh giá kết quả
Tế bào sau biệt hóa 21 ngày được đánh giá sự biểu hiện của calciumphosphate bằng nhuộm hóa mô. Các tế bào dương tính với thuốc nhuộm được cho là biệt hóa
thành công.
b. Phương pháp nhuộm Alizarin red Nguyên tắc
Alizarin (1,2-dihydroxyanthraquinone) là một loại thuốc nhuộm có nguồn gốc
thực vật. Trong rễ cây thiên thảo (Rubia tinctorum), chúng tồn tại ở dạng glycoside.
Alizarin còn bao gồm một nhóm các thuốc nhuộm tổng hợp từ các dẫn xuất nhựa than đá. Alizarin red là dẫn xuất của Alizarin, được sử dụng để phát hiện ra ion calci
có trong các mẫu mô hay tế bào. Sự kết hợp giữa ion calci và Alizarin red tạo ra
một phức hợp Alizarin red S-calci có màu đỏ cam.
Tiến hành
Quy trình nhuộm (theo quy trình của Susan L.Wall). - Khử nước mẫu tế bào bằng cồn 70%.
- Rửa lại mẫu bằng nước cất. - Ủ với thuốc nhuộm trong 5 phút.
- Kiểm tra sự xuất hiện màu đỏ cam dưới kính hiển vi đảo ngược. - Rửa mẫu nhiều lần bằng nước cất hay PBS để loại bỏ thuốc nhuộm. - Ghi nhận kết quả khi quan sát dưới kính hiển vi.
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đánh giá kết quả
Sau khi nhuộm các tế bào với thuốc nhuộm Alizarin red, các nguyên bào
xương sẽ có màu đỏ cam.
c. Biệt hóa thành tế bào mỡ
Nguyên tắc
Các tế bào tạo mỡ có nguồn gốc từ trung mô. Nên một trong những phương pháp để khẳng định tế bào gốc ứng viên là tế bào gốc trung mô là biệt hóa chúng thành dòng tế bào tạo mỡ. Thông qua việc bổ sung hỗn hợp dexamathasone, indomethacin, IBMX vào môi trường nuôi DMEM low glucose 10 % FBS. Các tế
bào tạo mỡ được phát hiện bằng phương pháp nhuộm Oil red.
Quy trình biệt hóa tạo mỡ [4] [55]
Quy trình biệt hóa MSC thành mỡ được tiến hành theo quy trình của Nadri, S. và cộng sự (2007), Phạm Văn Phúc và cộng sự (2009).
- Sử dụng môi trường biệt hóa mỡ (phụ lục 1.1) để nuôi cấy tế bào.
- Tế bào đạt 80% độ bao phủ khi nuôi cấy lớp đơn thích hợp cho cảm ứng biệt hóa.
- Nuôi cấy trong khoảng 21-28 ngày. - Thay môi trường 2 lần/tuần.
- Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học.
- Lipid có thể nhìn thấy rõ vào ngày thứ 7 và có thể quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược.
Đánh giá kết quả
Tế bào sau khi biệt hóa 21 ngày được đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong tế
bào chất bằng cách quan sát dưới kinh hiển vi và bằng nhuộm Oil red. Có sự biện
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
d. Phương pháp nhuộm Oil red
Nguyên tắc
Oil red là thuốc nhuộm có màu đỏ, hòa tan trong lipid. Khi nhuộm mẫu tế bào cố định, bất kì nơi nào có chứa các giọt mỡ, Oil red sẽ hòa tan vào trong đó làm
chúng có màu đỏ.
Tiến hành [36]
Quy trình nhuộm (theo quy trình của Nadri, S. và cộng sự 2007). - Loại bỏmôi trường nuôi.
- Cốđịnh tế bào bằng methanol trong 45 phút ở nhiệt độ phòng. - Nhuộm tế bào với Oil red (Sigma), ủ trong 10-20 phút.
- Loại bỏ thuốc nhuộm và rửa lại bằng nước cất. - Xem kết quảdưới kính hiển vi đảo ngược.
Đánh giá kết quả
Những tế bào mỡ sẽ có tích trữ các giọt mỡ màu đỏ của thuốc nhuộm.