Sau 72 giờ cảm ứng biệt hóa thành mỡ, các tế bào gốc trung mô (MSC) bắt đầu tròn lại và tích tụ các giọt mỡ bên trong tế bào chất, lúc đầu là các giọt mỡ nhỏ li ti sau đó các giọt mỡ nhỏ này hợp nhất lại và tạo thành các giọt mỡ lớn. Các giọt
mỡ lớn sau đó thành các giọt mỡ lớn hơn và ép nhân tế bào ra ngoài. Vì vậy, các MSC ban đầu hình dạng thoi dài sẽ chuyển dạng thành dạng bầu dục và cuối cùng là dạng hình cầu. Các tế bào mỡ bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 7 sau biệt hóa. Kết
quả này tương tự với các tác giả Nadri, S. và cộng sự (2007) và Oscar K. Lee và cộng sự (2007).
Sự tích tụ các giọt mỡ bên trong tế bào có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 hay 200 lần. Khi nhuộm với Oil red các giọt mỡ bắt màu đỏ.
Kết quả này cho thấy các MSC thu nhận theo quy trình trên có khả năng biệt hóa
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
x400
Hình 3.26. Kết quả nhuộm Oil red.
(a) Tế bào sau 21 ngày cảm ứng biệt hóa thành mỡ; tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất; (b) Kết
quả nhuộm với Oil red các tế bào biệt hóa thành mỡ cho thấy các giọt mỡ bắt màu với thuốc nhuộm Oil red cho màu đỏ.
Kết luận: Từ các kết quả trên có thể đưa ra một số kết luận sau:
- Các MSC được thu nhận từ tủy xương theo quy trình nuôi cấy chọn lọc có hình dạng giống các nguyên bào sợi khi bám trải.
- Các MSC thu nhận được có khả năng hình thành tập đoàn khi nuôi cấy ở mật độ
thấp, chúng biểu hiện các marker CD44, Sca-1 và Thy-1 đồng thời âm tính CD34,
CD45 và CD117.
- Các MSC có khả năng biệt hóa thành tế bào xương và mỡ khi được cảm ứng với môi trường thích hợp.
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Phần III: KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ BẰNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TUỶ XƯƠNG
Các kết quả trên cho thấy CCl4 liều 0,8 ml/kgđã có tác dụng gây xơ hóa gan
trên chuột, vì vậy lô này được chọn để tiến hành thử nghiệm điều trị xơ hóa gan trên
chuột nhắt trắng bằng phương pháp ghép đồng loại tế bào tủy xương (tiêm tĩnh
mạch đuôi). Chuột xơ hóa gan được chia thành 3 lô: lô CCl4 liều 0,8 ml/kg không
được điều trị, ghép 0,1 ml PBS/ con (lô CCl4-PBS); lô CCl4 liều 0,8 ml/kg được điều trị bằng phương pháp ghép 5x104MSC/0,1ml/con (lô CCl4-MSC); lô CCl4 liều 0,8 ml/kg được điều trị bằng phương pháp ghép 5x104BMC/0,1ml/con (lô CCl4- BMC). Hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô tủy xương (MSC), tế bào đơn
nhân tủy xương (BMC) trên mô hình chuột xơ hóa gan được đánh giá cũng dựa trên các chỉ tiêu sinh hóa (hoạt độ ALT-AST trong huyết tương), chỉ tiêu mô học
(nhuộm hematoxylin và eosin), sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (procollagen 1(I), integrin , ecto-5’-nucleotidase).
3.7. Kết quả xét nghiệm sinh hóa: hoạt độ enzym alanine transaminase (ALT),
enzym aspartate transaminase (AST) trong huyết tương
Máu tĩnh mạch đuôi chuột trong 3 lô: lô CCl4-PBS, lô CCl4-MSC, lô CCl4- BMC tiếp tục được thu nhận ở tuần thí nghiệm 11 (tức sau 3 tuần cấy ghép)để đánh
giá hiệu quả điều trị của tế bào thông qua xét nghiệm xác định hoạt độ ALT, AST
trong huyết tương. Khi tế bào gan bị tổn thương, các enzym trong dịch bào (bao gồm các enzym transaminase) rò rỉ vào trong máu nên có thể đo lường ALT, AST để chỉ thị cho sự hoại tử, tổn thương tế bào. Như vậy khi chuột được cấy ghép tế
bào, tế bào có hiệu quả điều trị nếu ALT và AST đo được phải giảm so với lô không được điều trị, kết quả điều trị tốt nhất khi hoạt độ của những enzym transaminase này quay lại mức bình thường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Bảng 3.3. Kết quả hoạt độ ALT, AST sau 3 tuần điều trị với PBS (đối chứng), MSC, BMC.
ALT/ AST Lô CCl4-PBS Lô CCl4-MSC Lô CCl4-BMC
ALT tuần 11 (U/L) 255,0±87,3 155,8±31,3 99±58,2 AST tuần 11 (U/L) 145,6±61,7 132,2±101,8 76,7±13,35
Sau 3 tuần nhận cấy ghép, kết quả hoạt độ ALT và AST trong huyết tương
chuột xơ hóa gan do CCl4 liều 0,8 ml/kg thu được như sau (bảng 3.3): hoạt độ ALT
trong huyết tương chuột lô CCl4-MSC là 155,8±31,3 U/L, lô CCl4-BMC là 99±58,2 U/L đều thấp hơn hẳn so với lô chuột không được điều trị (lô CCl4-PBS) 255,0±87,3 U/L. Đặc biệt là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đạt được ở lô CCl4- BMC và lô CCl4-PBS (p< 0,05). Hoạt độ ALT trong nhóm CCl4-BMC quay trở lại
gần với chỉ số ALT chuột bình thường không bị tổn thương gan (99±58,2 U/L so với ALT chuột uống dầu bắp trong 8 tuần 86,8±16,4 U/L).
Theo dõi kết quả ALT giữa các tuần 8-11 cũng rất phù hợp với đặc điểm sinh
lý tái sinh bù trừ của gan. Khi bị tác động liên tục của hóa chất gây độc CCl4, tế bào gan bị tổn thương làm rò rỉ các enzym transaminase vào trong máu, nên hoạt độ ALT đo được rất cao. Tuy nhiên, khi ngưng tác động của hóa chất, gan tự tăng sinh
hồi phục, các tế bào mới tạo ra thay thế dần các tế bào bị tổn thương, gan không giải
phóng quá mức ALT vào máu nữa nên hoạt độ ALT đo được ở tuần 11 (255,0±87,3 U/L) giảm so với tuần 8 (418,0±24,0 U/L), nhưng không thể phục hồi hoàn toàn quay về chỉ số ALT bình thường (86,8±16,4 U/L). Do đó, tác động điều trị cho giai đoạn này là rất cần thiết để giúp gan hồi phục chức năng.
Việc cấy ghép tế bào đã thể hiện hiệu quả điều trị làm giảm hoạt độ ALT
trong huyết tương ở cả hai lô CCl4-MSC, lô CCl4-BMC. Trong đó lô điều trị bằng
quần thể tế bào đơn nhân từ tủy xương (BMC) cho hiệu quả tốt hơn so (p<0,05 khác
biệt có ý nghĩa thống kê so với lô không điều trị) với lô điều trị bằng tế bào gốc
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận Tương tự, hoạt độ AST cũng được xác định sau khi thu nhận máu tĩnh mạch đuôi chuột ở các lô được điều trị tế bào (lô CCl4-MSC, lô CCl4-BMC) và không
được điều trị (lô CCl4-PBS). Trong khi hoạt độ AST trong huyết tương chuột thuộc
lô CCl4-PBS, lô CCl4-MSC vẫn giữ ở mức cao tương đương so với AST tuần 8
(145,6±61,7 U/L ở lô CCl4-PBS, 132,2±101,8 U/L đối với lô CCl4-MSC và 137,5±49,9 U/L ở chuột uống CCl4 trong 8 tuần); ở nhóm điều trị bằng tế bào tủy
xương (lô CCl4-BMC) hoạt độ của enzym AST này là 76,7±13,35 U/L (bảng 3), quay trở lại gần với chỉ số AST chuột uống dầu bắp trong 8 tuần không bị tổn thương gan (57,8±6,9 U/L) và hoạt độ AST thấp hơn so với nhóm chuột không được điều trị (145,6±61,7 U/L).
So sánh kết quả ALT-AST của đề tài với kết quả của Sivasami và cộng sự
(2010) ghép 1x106 MSC hoặc 1x106 tế bào gốc tạo máu (HSC) vào chuột Balcđã bị gây độc gan bằng CCl4 1ml/kg (CCl4 được pha trong ôliu theo tỉ lệ 1: 1) trong 3 ngày xen kẽ trước đó. Kết quả cho thấy MSC có vai trò làm giảm hoạt độ các
enzym transaminase ALT, AST lần lượt là 215±35 U/L, 345±19 U/L so với nhóm
chuột CCl4 1ml/kg không được điều trị 542±23 U/L (ALT) 654±11U/L (AST)
(p<0,01). Như vậy kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với kết quả Sivasami
và cộng sự (2010) về vai trò giảm hoạt độ AST của MSC cấy ghép. Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, MSC chưa thể hiện rõ tác động trên hoạt độ ALT (p>0,
05) và kết quả này là tương đồng so với kết quả nghiên cứu của M.T. Abdel Aziz và cộng sự (2007). Kết quả ALT-AST giảm trong lô CCl4-BMC cũng phù hợp với kết
quả của Cheuk-Kwan Sun và cộng sự (2010).
Sở dĩ MSC giúp giảm sự rò rỉ các enym transaminase này vào trong máu là do MSC có khả năng tiết ra một số yếu tố hòa tan như nitric oxid, prostaglandin,... giúp tăng khả năng phòng vệ chống oxy hóa đồng thời ức chế các yếu tố gây phản ứng oxy hóa, ức chế sự tăng sinh và thâm nhiễm của các tế bào gây viêm, ngăn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận Tương tự, quần thể tế bào đơn nhân tủy xương cũng có khả năng bảo vệ gan
thông qua tác dụng giảm các tác nhân oxy hóa tạo gốc tự do, giúp ngăn sự hoại tử
hay apoptosis tế bào gan và tăng cường chức năng của ti thể do đó hoạt độ ALT- AST trong lô CCl4-BMC giảm (Cheuk-Kwan Sun và cộng sự, 2010).
Như vậy dựa vào chỉ tiêu sinh hóa hoạt độ ALT-AST để đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào tủy xương như sau: MSC đã có vai trò hồi phục trên hoạt độ
AST, BMC lại thể hiện hiệu quả điều trị rất tốt trên cả hai hoạt độ ALT, AST, có xu hướng quay trở về mức bình thường (lúc gan chưa bị tổn thương).
3.8.Kết quả nhuộm mô học hematoxylin và eosin
Song song với việc đánh giá hiệu quả điều trị tế bào tủy xương thông qua hoạt độ ALT, AST; tác động lên sự thay đổi mô học của tế bào tủy xương cũng được theo dõi. Gan chuột được sinh thiết, sau đó được nhuộm mô học hematoxylin và eosin đánh giá sự hoại tử và mức độ xơ hóa sau khi cấy ghép tế bào tủy xương.
Về cấu trúc đại thể gan chuột thuộc nhóm đối chứng không được điều trị
(CCl4-PBS) có màu đỏ nhạt, có nhiều hạt nổi lên làm bề mặt gan gồ ghề, gan săn lại
(hình 3.27). Trong khi đó gan chuột ở hai lô điều trị tế bào (CCl4-MSC, CCl4- BMC) có màu đỏ tươi, bề mặt gan nhẵn bóng gần như bình thường, tuy nhiên vẫn chưa hoàn toàn đồng nhất về màu sắc như gan bình thường.
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Hình 3.27. Cấu trúc đại thể gan chuột sau 3 tuần tiêm 0,1 ml PBS (lô CCl4-PBS), 5x104 tế bào gốc trung mô tủy xương (lô CCl4-MSC), 5x104 tế bào đơn nhân tủy xương chuột (lô CCl4-
BMC).
Quan sát cấu trúc mô học (hình 3.28) cho thấy có sự khác nhau giữa lô chuột được điều trị (lô CCl4-MSC, lô CCl4-BMC) và không điều trị (lô CCl4-PBS). Tuy nhiên không thấy có sự khác biệt trong cấu trúc mô học giữa lô được điều trị bằng
tế bào gốc trung mô (lô CCl4-MSC) và lô điều trị bằng tế bào đơn nhân tủy xương
(lô CCl4-BMC).
Cụ thể là ở lô CCl4-PBS, cấu trúc vi thể gan có các vùng hoại tử rải rác trong
nhu mô, và quanh tĩnh mạch trung tâm, có những ổ hoại tử tế bào gan, gan viêm, tế
bào gan phản ứng (nhân to, phồng), tế bào với nhân thoái hóa, rải rác các tế bào sợi,
có sự tăng sinh tái tạo. Như vậy gan chuột không được điều trị vẫn không ngừng đáp ứng lại với chất độc, bằng cách tăng sinh bù bởi chính tế bào gan còn lại sau tổn
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận thương và bởi các tế bào sợi thay thế bù đắp số lượng và chức năng của tế bào đã mất.
Trong khi đó cấu trúc vi thể gan ở lô CCl4-MSC không thấy xuất hiện những
vùng hoại tử, tế bào gan với nhân hoạt động, tăng sinh tái tạo. Gan đã có dấu hiệu
hồi phục, mức độ tổn thương giảm đáng kể so với nhóm không được điều trị. Trong
gan chuột lô CCl4-MSC không thấy các vùng hoại tử có thể là do vai trò ức chế các
nguồn gây phản ứng oxy hóa của MSC luôn đi kèm với tác động tăng khả năng
phòng vệ chống oxy hóa (Sivasami và cộng sự, 2010). MSC có thể biệt hóa thành tế
bào gan in vitro, in vivo, trong mô hình gan tổn thương (Wu và cộng sự; Luk và cộng sự; Sato và cộng sự, 2005; Schwartz và cộng sự, 2002; Lange và cộng sự, 2005; Ong và cộng sự, 2006; Yamamoto và cộng sự, 2008) để thay thế chức năng
của những tế bào gan đã mất. Bên cạnh đó, gan chuột được ghép MSC cũng giảm
viêm có thể là do MSC có vai trò ức chế các tế bào gây viêm hoặc điều hòa giảm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mức các yếu tố gây viêm. Giải thích này dựa trên các kết quả nghiên cứu của
Sivasami và cộng sự (2010), nhóm này đã chứng minh vai trò của MSC trong ức
chế sự tăng sinh và trưởng thành của tế bào B in vitro, ngăn tế bào B, T đi vào pha
G0/G1 của chu trình tế bào. Tác động gây viêm của các tế bào B cũng bị ức chế do MSC điều hòa giảm mức sự biểu hiện của các thụ thể chemokin, ngăn sự tổng hợp
immunoglobin. Sự tăng sinh và thâm nhiễm của các tế bào gây viêm cũng bị ức chế
bởi MSC.
Về kết quả nhuộm hematoxylin và eosin ở lô chuột được điều trị tế bào đơn
nhân tủy xương (lô CCl4-BMC) cho thấy mô gan phản ứng, tái tạo tế bào gan, có sự
xâm nhập của lympho bào, viêm gan mạn tính, đặc biệt là không thấy những vùng hoại tử trong nhu mô. Rõ ràng là, tế bào đơn nhân tủy xương đã có vai trò tích cực
giúp gan hồi phục sau tổn thương do CCl4. Có lẽ là do BMC giúp tăng cường khả năng tái sinh của gan, hoặc một số tế bào gốc trong tủy xương có khả năng biệt hóa
thành tế bào gan (Miyazaki M và cộng sự, 2007) thay thế vùng hoại tử cùng với tác
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận
Sun và cộng sự, 2009). Đồng thời BMC cũng ức chế sự biểu hiện, hoạt hóa tế bào hình sao, giảm tổng hợp chất nền, giảm xơ hóa.
Kết quả mô học trong lô CCl4-BMC cũng phù hợp với kết quả sinh hóa ALT-
AST đều giảm đáng kể so với lô đối chứng không được điều trị. Đặc biệt là sự khác
biệt ALT đạt ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa lô CCl4-BMC và lô CCl4-PBS. Tác dụng giảm hoại tử tế bào gan đã ngăn sự rò rỉ các enzym transaminase này vào huyết tương. Tuy nhiên ở lô CCl4-MSC hoạt độ của những enzym này có giảm nhưng sự khác biệt hoạt độ ALT không đáng kể so với lô CCl4-PBS mặc dù giảm
vùng hoại tử trên cấu trúc mô học. Có thể là quá trình apoptosis của các tế bào trong gan vẫn tiếp tục đẩy mạnh nên các enzym vẫn tiếp tục tăng cao trong huyết tương
của chuột lô CCl4-MSC hoặc các tế bào tổn thương vẫn chưa được thay thế hoàn toàn bởi các tế bào gan mới.
Hình 3.28. Cấu trúc vi thể gan chuột sau 3 tuần điều trị (a) lô CCl4-PBS, (b) lô CCl4-MSC, (c) lô CCl4-BMC (kết quả nhuộm H&E).
So sánh kết quả mô học của đề tài với kết quả củaSivasami và cộng sự (2010)
Trần Hồng Diễm Kết quả – Biện luận Cấu trúc vi thể ở chuột tiêm phúc mạc CCl4 1ml/kg không được điều trị biểu hiện
tĩnh mạch giãn rộng, mất tế bào gan, nhiều tế bào viêm thâm nhập vào xoang mao mạch và vùng trungtâm. Gan ở lô chuột CCl4 1 ml/kg được được ghép 1x106 MSC có dấu hiệu khả quan hơn, cấu trúc gan bình thường với tĩnh mạch trung tâm và bề
gan toả tròn (hình 3.29).
x100
Hình 3.29. Cấu trúc vi thể gan chuột trong nghiên cứu của Sivasami và cộng sự (2010) (kết quả nhuộm H&E).
Chuột được tiêm phúc mạc CCl4 1ml/kg (CCl4 được pha trong dầu ôliu theo tỉ lệ 1: 1) trong 3 ngày xen kẽ, (Cont) lô không được điều trị và (MSC) lô được ghép 1x106 MSC.
Như vậy về kết quả mô học cả tế bào gốc trung mô và tế bào tủy xương đều có
tác dụng cải thiện cấu trúc vi thể gan, vai trò nổi bật nhất đó là không còn thấy hoại
tử trong gan, tuy nhiên tác dụng này vẫn chưa hoàn toàn, có thể là do số lượng tế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bào ghép còn ít (5x104 tế bào), hoặc thời gian chưa đủ để gan hồi phục hoàn toàn.
Để khẳng định kết quả này sự tổng hợp chất nền ngoại bào, sự hiện diện của tế bào tạo xơ hóa,… tiếp tục được kiểm tra bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
3.9.Kết quả đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin
, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã.
Hiệu quả điều trị của tế bào tủy xương tiếp tục được đánh giá trên sự biểu hiện
gen mã hóa cho các chất nền ngoại bào: procollagen α1(I), integrin , và enzym ecto-5’-nucleotidase thúc đẩy sự phát sinh xơ hóa ở mức phiên mã. Tế bào tủy