eosin
Cơ sở chọn lựa phương pháp[56] [62] [67]
Xét nghiệm mô học hữu dụng trong việc xác định nguyên nhân bệnh, đánh giá
mức độ viêm-hoại tử và giai đoạn tiến triển của xơ hóa (sử dụng các thang chuẩn như Metavir, tỷ số Ishak). Các phương pháp nhuộm phổ biến bao gồm nhuộm
hematoxylin và eosin (H&E), Masson trichrom, sirius red,…Trong đó, nhuộm
hematoxylin và eosin là phương pháp thường dùng nhất trong cả thực nghiệm
(Wang xian Tang và cộng sự, 2003; Christian Eipel và cộng sự, 2006; Zhongsheng Peng, 2008; Sivasami và cộng sự, 2010;...) lẫn lâm sàng, do chi phí không cao và có thể cho biết nhiều thông tin bệnh lý (sự xơ hoá, sự thâm nhập của tế bào viêm, hoại
tử tế bào, thoái hoá tế bào…).
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.6. Các thao tác sinh thiết.
(a) Gây mê chuột, (b) Phẫu thuật mở bụng, (c) Thu mẫu gan, (d) Bảo quản mẫu gan trong đệm
formalin-phosphate, (e) Khâu vết mổ, (f) Chuột đã được khâu hoàn tất.
b. Phương pháp nhuộm hematoxylin và eosin [8] Nguyên tắc
Nhuộm hematoxylin và eosin là một phương pháp nhuộm phổ biến trên nhiều
loại mô khác nhau, nhằm kiểm tra sự thay đổi hình thái mô học, ứng dụng trong
chẩn đoán bệnh, đặc biệt trong chẩn đoán ung thư. Hai thành phần chính hoạt động
trong thuốc nhuộm là hematoxylin và eosin.
Hematoxylin (công thức phân tử: C16H14O6, phân tử lượng: 302,28 g/mol)
được chiết xuất từ gỗ cây huyết mộc. Sản phẩm oxy hóa của hematoxylin là haematin, một hợp chất tạo phức hợp màu mạnh với các ion kim loại đặc biệt là Fe (III) và Al (III). Các phức hợp kim loại-haematein được sử dụng để nhuộm nhân tế
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.7. Công thức cấu tạo của hematoxylin.
Eosin có màu đỏ là do hoạt động của brom trên flourescein. Eosin được sử
dụng để nhuộm tế bào chất, collagen và các sợi cơ. Cấu trúc bắt màu với eosin là những cấu trúc ưa acid. Hầu hết tế bào chất là ưa acid. Tế bào hồng cầu được
nhuộm màu hoàn toàn đỏ với eosin. Có 2 loại thuốc nhuộm eosin phổ biến là eosin Y (eosin Yellowish là dẫn xuất tetrabromo của flourescein) màu vàng nhạt; và eosin B (eosin Bluish là dẫn xuất dibromo dinitro của flourescein) màu xanh nhạt.
Hình 2.8. Công thức cấu tạo của eosin Y (a) và eosin B (b). Tiến hành
Theo quy trình nhuộm của bệnh viện Chợ Rẫy.
Mẫu gan cố định trong đệm formalin-phosphate, sau đó được đóng trong paraffin.
Cắt mẫu paraffin thành lát mỏng 4 µm. Làm tan lát cắt trong paraffin ở nhiệt độ 56
– 600C trong tủ ấm, trải lên lame. Tiến hành nhuộm mẫu theo quy trình như sau:
Xylen I ngâm 5 phút
Xylen II ngâm 5 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Alcohol 100 ngâm 1 phút Alcohol 90 ngâm 1 phút
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Alcohol 80 ngâm 1 phút
Rửa nước 2 phút
Hematoxylin ngâm 4 phút Rửa nước thường 1 phút Acid alcohol 1% nhúng 2 lần
Rửa nước thường
Ammoniac nhúng 2 lần
Rửa nước thường 5 phút
Alcohol 70 ngâm 2 phút Eosin ngâm 3 phút Alcohol 90 ngâm 1 phút (×2 lần) Alcohol 100 ngâm 1 phút Alcohol 100 ngâm 2 phút Xylen ngâm 5 phút Dán lame bằng Permount. Đánh giá kết quả [5] [32]
Trong các mô thông thường, nhân được nhuộm màu xanh, trong khi tế bào chất và chất nền ngoại bào được nhuộm màu hồng với nhiều mức độ khác nhau.
Các tế bào được cố định tốt có thể cho thấy được các đặc điểm chi tiết bên trong nhân. Nhân biểu thị các trạng thái khác nhau của sợi nhiễm sắc đặc trưng với từng
loại tế bào và kiểu ung thư. Hạch nhân được nhuộm màu với eosin. Nếu hiện diện
một lượng lớn các polyribosom, tế bào chất sẽ có một màu xanh khác biệt. Do vậy,
thuốc nhuộm này cho biết nhiều thông tin về cấu trúc với các gợi ý về chức năng đặc trưng.
Sự thoái hóa mỡ tế bào gan được quan sát thấy khi các tế bào gan sưng phồng,
có tích tụ các nang mỡ. Vị trí của các tế bào thoái hoácó thể cho biết được nguyên nhân của sự thoái hoá. Có thể chia một tiểu thuỳ gan thành ba vùng từ ngoài khoảng
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp cửa đi vào trong tĩnh mạch trung tâm: vùng A1, A2 và A3 (hình 2.10 b). Thoái hoá
mỡ do ngộ độc: hoá chất đi từ tĩnh mạch cửa vào tĩnh mạch trung tâm nên vùng tế bào bị ảnh hưởng đầu tiên là vùng A1. Thoái hoá mỡ do rượu thường ở vị trí giữa tiểu thuỳ – vùng A2. Thoái hoá mỡ do suy tim sẽ có vị trí ở quanh tĩnh mạch trung
tâm – vùng A3, do lượng oxy cung cấp cho các tế bào ở vùng này là ít nhất trong ba
vùng (oxy cung cấp đi từ khoảng cửa vào) gây rối loạn biến dưỡng ở các tế bào này.
Thoái hoá mỡ do suy dinh dưỡng thường không phân vùng và phân bốrải rác trong tiểu thuỳ.
Hình 2.9. Một tiểu thùy gan bình thường với 3 vùng tế bào.
(a) Một tiểu thuỳ gan chuột bình thường có dạng hình lục giác với một tĩnh mạch trung tâm (CV) ở giữa và sáu portal triad (PT) ở xung quanh (mẫu nhuộm H&E ×100), (b) Các vùng tế bào A1, A2
và A3 trong một tiểu thuỳ.
Hoại tử gan được đánh giá dựa trên sự mất trật tự của các phiến tế bào gan, sự
thâm nhập các tế bào gây viêm ở vùng quanh khoảng cửa, tế bào chất đồng nhất,
nhân kết đặc, màng nhân có thể rách vỡ, nhân phân mảnh và dần dần có thể biến mất. Sự xơ hóa được xác định khi có sự hiện diện của các dải sẹo sợi trong nhu mô
gan. Khi các vùng xơ hóa phát triển, có sự bắt cầu giữa các khoảng cửa bao quanh các nhu mô đang tái sinh còn lại tạo thành các nốt nhỏ dày đặc, các dấu hiệu này
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
2.2.2.3.Đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cơ sở lựa chọn phương pháp[13] [18] [20] [19[25] ] [31] [33] [41] [52] [64] [67]
Xơ hóa gan liên quan đến những thay đổi chủ yếu về cả lượng lẫn thành phần
chất nền ngoại bào (Benyon và Iredale, 2000). Trong gan xơ hóa sự tích tụ và phân bố chất nền ngoại bào tăng cao gấp nhiều lần so với gan bình thường không bị tổn thương (Rebecca G. Wells, 2006). Sự tích tụ chất nền ngoại bào là kết quả của cả sự tăng tổng hợp lẫn sự giảm thóai biến chất nền (Du Wei Dong và cộng sự, 1999; Arthur M.J, 2000; Rebecca và cộng sự, 2006; M.T Abdel Aziz và cộng sự, 2007). Sự tăng tổng hợp chất nền (collagen, fibronectin,…) là kết quả của sự tăng biểu hiện
và hoạt tế bào hình sao hay tế bào tạo sợi (-SMA, integrin 1,..) (Milani và cộng
sự, 1990; Marra 1999, Francis J. Eng và cộng sự, 2000; Gabele và cộng sự, 2003; Eduardo Farias và cộng sự, 2005; Xiao-wei Huang và cộng sự, 2010). Sự tăng biểu
hiện những tế bào này được điều hòa bởi nhiều tín hiệu, chất nội sinh từ mô tổn thương (TNF-, TGF-, ecto-5’-nucleotidase,…) (Zimmermann 2000; Kinnman và Housset, 2002; Magness và cộng sự, 2004; Jiantu Che và cộng sự, 2007; Zhongsheng Peng, 2008; Cláudia M.B. và cộng sự, 2008; Majid Katebi và cộng sự,
2009).
Do đó để đánh giá tác động gây độc của CCl4 liều 0,8 ml/kg trên gan bên cạnh
những chỉ tiêu sinh hóa (ALT, AST), đánh giá mô học (hematoxylin và eosin), chúng tôi tiến hành đánh giá sự biểu hiện gen mã hóa cho procollagen α1(I),
integrin 1, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã đại diện cho chất nền gây xơ hóa,
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
a. Phương pháp tách RNA tổng số bằng hóa chất Trizol
Nguyên tắc
Trizol là một hóa chất có thể dùng để tách đồng thời DNA, RNA, protein một
cách nhanh chóng và dễ dàng từ mẫu mô, hay tế bào của người, động vật, thực vật,
nấm men, vi khuẩn, virus,…Trizol là một hỗn hợp gồm guanidine thiocyanat và phenol trong cùng một pha. Trizol có hiệu quả giải phóng DNA, RNA, protein dựa
trên khả năng đồng nhất hay phân rã mẫu mô. Sau khi thêm chloroform vào ly tâm, dung dịch được tách thành 3 pha: pha nước chứa RNA, pha giữa chứa DNA, pha
hữu cơ chứa protein. RNA, DNA, hay protein được tách ra từ mỗi pha trên. Trong nghiên cứu của chúng tôi, mục đích thu nhận là RNA nên pha nước được thu nhận
Quy trình tiến hành
- Mẫu gan 20-25 g được cho vào eppendorf 1,5 ml. - Bổ sung 0,5 ml trizol vào eppendorf.
- Mẫu được cắt nhuyễn bằng kéo cho đến khi thấy dung dịch nhớt, huyền phù. - Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút, 4oC.
- Thu dịch nổi cho vào eppendorf mới.
- Bổ sung 200 l chloroform vào dịch nổi, đảo nhẹ. - Eppendorf được ủ lạnh để dung dịch bên trong tách lớp. - Ly tâm 12000 vòng trong 5 phút, 4oC.
- Thu lớp dịch phía trên cùng, cho vào eppendorf chứa sẵn 250 l isopropanol, đảo
nhẹ.
- Ủ eppendorf ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 12000 vòng trong 5 phút, 4oC. - Đổ bỏ dịch, thu cắn.
- Cho 1ml ethanol tuyệt đối vào eppendorf chứa cắn. - Ly tâm 12000 vòng trong 5 phút, 4oC.
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
- Cho 1ml ethanol tuyệt đối vào eppendorf chứa cắn. - Ly tâm 12000 vòng trong 5 phút, 4oC.
- Đổ bỏ dịch, thu cắn. - Để cắn khô tự nhiên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cho 20 l nước cất vào cắn, huyền phù đều.
b. Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription – PCR) Nguyên tắc [3]
RT-PCR là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phát hiện là RNA. Để
có thể thực hiện được việc này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược
thành cDNA, rồi sau đó dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng
cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này.
Có hai phương pháp thực hiện RT-PCR. Đó là phương pháp RT-PCR một bước và phương pháp RT-PCR hai bước. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR một bước. Nghĩa là cả hai giai đoạn RT và PCR được thực
hiện trong cùng một ống phản ứng. Giai đoạn RT sẽ được thực hiện trước, giai đoạn
PCR sẽ diễn ra liền sau đó. Trong phương pháp RT-PCR một bước, toàn bộ sản
phẩm cDNA đều tham gia vào bước PCR và không nhất thiết phải thiết kế mồi
riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho RT.
Tiến hành
Chuẩn bị phản ứng: cho lần lượt các thành phần sau vào eppendorf 200 µl
Nước cất 2 lần 7 µl
PCR master mix 8 µl
Mồi 3 µl
RNA 2 µl
Tổng thể tích phản ứng là 20 µl được trộn đều nhẹ nhàng, không tạo bọt khí.Sau đó
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR
Sự biểu hiện của mRNA procollagen α1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase
được đánh giá bằng RT-PCR. RNA tổng số được tách từ gan bằng hóa chất tách
RNA Trizol (Sigma) theo quy trình của nhà sản xuất. RNA được khuyếch đại với
những mồi chuyên biệt cho procollagen α1(I), integrin 1, ecto-5’-nucleotidase, GAPDH. Trình tự mồi xuôi procollagen α1(I) 5’-CCT GGA CGC CAT CAA GGT CTA C-3’ và trình tự mồi ngược 5’-CCA AGT TCC GGT GTG ACT CG-3’, kích
thước sản phẩm khuyếch đại là 419 bp. Trình tự mồi xuôi integrin 1 5’-GCC AGG GCT GGT TAT ACA GA-3’ và trình tự mồi ngược 5’-TCA CAA TGG CAC ACA GGT TT-3’, kích thước sản phẩm khuyếch đại là 226 bp. Trình tự mồi xuôi ecto-5’- nucleotidase 5’–CCT CTC AAA TCC AGG GAC AA-3’ và trình tự mồi ngược 5’- TTT GGA AGG TGG ATT TCC TG-3’, kích thước sản phẩm khuyếch đại là 220 bp. GAPDH được sử dùng làm đối chứng nội với trình tự mồi xuôi 5’-AAG TTG TCA TGG ATG ACC-3’ và trình tự mồi ngược 5’-ATC ACC ATC TTC CAG GAG C-3’, kích thước sản phẩm khuyếch đại là 300 bp. RT-PCR 1 bước được tiến hành với điều kiện khuyếch đại như sau: phản ứng được giữ ở nhiệt độ 450C trong 40 phút để mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA và enzym reverse transcriptase tổng hợp được cDNA, đồng thời RNase cắt bỏ RNA đích khỏi cDNA; sau đó biến tính
enzym reverse transcriptase, RNase ở 940C trong 2 phút; biến tính ở 940C trong 45 giây, bắt cặp ở 55 trong 45 giây, kéo dài ở 720C trong 1 phút, 3 giai đoạn này được
tiến hành với 35 chu kỳ; giai đoạn cuối cùng kéo dài thêm 1 chu kỳ ở 720C trong 10 phút.
Đánh giá kết quả
Sản phẩm sau phản ứng (cDNA) được điện di trên gel agarose 1,6% pha trong
đệm TAE 1X, điện di ở cường độ dòng điện 300 mA trong 60 phút. Bản gel sau điện di được ngâm trong TAE 0,5X có bổ sung ethidium bromide. Cường độ phát (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
DNA được ước định dựa vào làn dấu khối lượng phân tử (DNA molecular marker)
hay còn gọi là thang chuẩn.
c. Phương pháp điện di
Phương pháp điện di trong gel thường được sử dụng để phân li (phân đoạn)
DNA, RNA, oligonucleotide, protein... sau đó có thể dùng để giám biệt (đồng định)
và tinh chế các chất đó. Việc phân li các chất dựatrên độ lớn cũng như hình thái của
các chất.
Nguyên tắc
Nguyên tắc của việc điện di DNA (trong đề tài của chúng tôi là cDNA) là khi
ở trongđiện trường, do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía cực
âm với tốc độ dịch chuyển khác nhau phụ thuộc vào khốilượng phân tử của chúng.
Các đoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là từ một điểm chung
("lỗ răng lược hay giếng" tải mẫu) các đoạn DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn đó cócác đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng.
Tiến hành
Phương pháp chuẩn bị gel Agarose (1,6% ) (phụ lục 1.2)
Phương pháp điện di agarose (phụ lục 1.2)
Hình 2.10. (a) Thao tác load mẫu vào lỗ răng lược (giếng) bằng micropipette, (b) Điện di agarose mẫu cDNA trong bể điện di nằm ngang.
Trần Hồng Diễm Vật liệu – Phương pháp
Phương pháp kiểm tra băng cDNA
- Ngâm bản gel sau khi điện di 10-20 phút trong dung dịch TAE 0,5X có bổ sung
thuốc nhuộm ethidium bromide ở nồng độ 0,5 µg/ml.
- Đặt bản gel trên nguồn đèn tử ngoại (UV) để có thể phát hiện được các băng
cDNA.
Hình 2.11. Kết quả điện di một số đoạn DNA trong gel agarose [3].
Hai làn hai bên là dấu khối lượng phân tử (DNA molecular marker) hay còn gọi là thang chuẩn, mỗi băng (vạch sáng) của mỗi làn này cách nhau 100 base pair
(bp), băng nhỏ nhất (dưới cùng) "nặng" 100 bp, băng nặng nhất 2000 bp (giữa 1000
bp và 2000 bp không có các băng trung gian).
Đánh giá kết quả
Để ước định khối lượng phân tử làn DNA nào đó thì có thể đặt một thước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thẳng lên nó và dóng ngang xem nó tương ứng với băng nào trong làn dấu khối lượng phân tử, trường hợp không trùng khít thì có thể ước lượng.