* Bệnh nhân lao phổi ựiều trị lại: tái phát, thất bại và mạn tắnh. * Bệnh nhân đTđ bị lao phổi mới có kết hợp bệnh HIV.
* Bệnh nhân không tự nguyện tham gia nghiên cứụ
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Sử dụng phương pháp tiến cứu mô tả, so sánh các nhóm bệnh lao phổi mới AFB(+) kết hợp đTđ và nhóm bệnh lao phổi mới AFB(+) không có đTđ.
2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
2.2.2.1. Cỡ mẫu
Cỡ mẫu ựược tắnh theo công thức ước lượng khác biệt tỷ lệ % của 2 nhóm mô tả [60]. 2 2 1 2 2 1 1 ) . ( 2 ) ( ) 1 ( ) 1 ( . P P P P P P Z n − − + − = α β x d
n : cỡ mẫu của mỗi nhóm nghiên cứụ
P1: tỷ lệ kháng ựa thuốc của bệnh nhân lao phổi mới kết hợp đTđ.
P2: tỷ lệ kháng ựa thuốc của bệnh nhân lao phổi mới không có đTđ.
α: mức ý nghĩa thống kê; β: hiệu lực thống kê.
d: hệ số thiết kế (design effect)
* Công thức tắnh trên trong ựề tài này: α = 0,05; β = 0,1
Hiện nay ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu kháng thuốc của bệnh nhân lao phổi mới kết hợp đTđ. Kết quả ựiều tra về tình hình kháng thuốc của Chương trình Chống lao Quốc gia năm 1997 cho thấy kháng ựa thuốc ở bệnh nhân lao mới chiếm 2,3% [13]. Theo báo cáo của TCYTTG, tỷ lệ kháng ựa thuốc bệnh nhân lao mới ở Ấn độ là 2,8% [166] chỉ cao hơn của Việt Nam là 0,5%. Dựa theo kết quả nghiên cứu của các tác giả nước ngoài quan tâm về tỷ lệ kháng ựa thuốc ở bệnh nhân lao kết hợp đTđ cho thấy tỷ lệ kháng ựa thuốc của nhóm ựối tượng này ở Ấn độ năm 2003 là 26% [166] và nghiên cứu khác ở bang Texas và Mexico (USA) là 3,4% và 7,8% [110]. để thực hiện nghiên cứu, trong ựề tài này giả ựịnh tỷ lệ kháng ựa thuốc ở bệnh nhân lao phổi mới AFB(+) kết hợp bệnh đTđ tương ựương với kết quả nghiên cứu của Ấn độ là 26%.
P1 = 0,26; P2 = 0,023 α = 0,05 β = 0,1 Chọn d = 1,5 P1(1-P1) + P2(1-P2) n= Z(α,β) x (P1-P2) xd 0,26 (1-0,26) + 0,023(1-0,023) n= 10,5 x (0,26-0,023) x 1,5 = 114,1
Như vậy cỡ mẫu của mỗi nhóm cần ựạt ắt nhất 114 bệnh nhân.
2.2.2.2. Kỹ thuật chọn mẫu * đối với nhóm N1 và N2:
- Bệnh nhân từ 16 tuổi trở lên, không phân biệt giớị
- Bệnh nhân ựáp ứng 1 trong 3 tiêu chuẩn của bệnh nhân lao phổi mớị Có hoặc không có 1 trong 3 tiêu chuẩn chẩn ựoán đTđ và không phân biệt đTđ týp 1 và đTđ týp 2.
* đối vói nhóm N3: người bình thường không có dấu hiệu của đTđ cũng như của mắc lao theo phương pháp chẩn ựoán cộng ựồng ựược chọn lọc qua danh sách khám sức khoẻ của một cơ quan tại Hà Nộị
Trong thời gian (3/2004 - 8/2008) nghiên cứu sinh ựã thu nhận ựược 130 bệnh nhân lao phổi mới AFB(+) có đTđ và 130 bệnh nhân phổi mới AFB(+) không có đTđ ựáp ứng ựủ số lượng bệnh nhân so với cỡ mẫu yêu cầụ
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP THU THẬP SỐ LIỆU VÀ đÁNH GIÁ KẾT QUẢ VÀ đÁNH GIÁ KẾT QUẢ
2.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu lâm sàng, Xquang, một số XN thường quỵ
2.3.1.1. Thông tin cơ bản
Mỗi bệnh nhân ựược nghiên cứu sinh trực tiếp thăm khám và theo dõi ựiều trị, ghi vào bệnh án mẫu với các nội dung chủ yếu sau:
* Giới: nam, nữ.
* Tuổi: tuổi trung bình, phân nhóm theo CTCLQG [10], xếp 4 nhóm: - Nhóm tuổi từ 16 - < 35.
- Nhóm tuổi từ 35 - 44. - Nhóm tuổi từ 45 - 54. - Nhóm tuổi > 54.
2.3.1.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu lâm sàng
* Tắnh chỉ số khối cơ thể (BMI: Body Mass Index): ựo chiều cao, cân nặng bằng cân bàn SMIC Trung Quốc, có gắn thước ựo chiều cao ựể tắnh chỉ số BMI theo công thức của TCYTTG 1996 [19].
cân nặng (kg) BMI (chỉ số Quetelet) =
chiều cao2 (m2)
Bảng 2.1. đánh giá mức ựộ BMI theo tiêu chuẩn của TCYTTG (1996) [19].
Giới Quá gầy Gầy Hơi gầy Bình
thường Béo Quá béo
Nam <16 16,1 - 18 18,1 - 20 20,1 - 25 25,1 - 30 >30
* Lý do vào viện.
* Tiền sử tiếp xúc nguồn lây, một số yếu tố nguy cơ.
* Cách khởi phát của bệnh: cấp tắnh, từ từ, hoặc không có triệu chứng.
- Khởi phát cấp tắnh với biểu hiện lâm sàng: sốt > 390C, ho khạc ra máu số lượng nhiều, khó thở nhiều, ựau ngực.
- Khởi phát từ từ (bán cấp) với biểu hiện lâm sàng: các triệu chứng xuất hiện từ từ, không rầm rộ; sốt từ > 370C ựến < 390C, mệt mỏi chán ăn mức ựộ vừa, gầy sút cân từ từ, ra mồ hôi ựêm, ho khạc ựờm, ho ra máu số lượng ắt, tức ngực nhẹ, khó thở mức ựộ vừạ
- Khởi phát không có triệu chứng: phát hiện bằng Xquang phổị * Trình tự phát hiện bệnh lao phổi và đTđ:
-đTđ phát hiện trước.
- đTđ và lao phổi cùng ựược phát hiện. - Lao phổi phát hiện trước.
* Thời gian từ khi bị đTđ ựến khi mắc lao phổi:
- Thời gian từ khi bị đTđ ựến khi mắc lao phổi <1 năm. - Thời gian từ khi bị đTđ ựến khi mắc lao phổi: 1-5 năm. - Thời gian từ khi bị đTđ ựến khi mắc lao phổi >5 năm.
* Thời gian phát hiện bệnh lao: tắnh từ khi bệnh nhân xuất hiện triệu chứng ựầu tiên ựến khi bệnh nhân nhập viện và ựược phát hiện bệnh.
- Thời gian phát hiện bệnh lao < 2 tháng
- Thời gian phát hiện bệnh lao từ 2 tháng ựến < 4 tháng - Thời gian phát hiện bệnh lao từ 4 tháng ựến < 6 tháng - Thời gian phát hiện bệnh lao từ 6 tháng
* Nơi khám và phát hiện bệnh lao ựầu tiên. * Nơi khám và phát hiện bệnh đTđ ựầu tiên.
- Các triệu chứng toàn thân: sốt, mệt mỏi, chán ăn, gầy sút cân.
- Triệu chứng cơ năng: ho khan, ho khạc ựờm, ho ra máu, ựau ngực, khó thở. - Các triệu chứng thực thể ở phổi: chủ yếu là các dấu hiệu nghe phổi (các ran, các hội chứng ở phổi).
- Bệnh lao ngoài phổi có phối hợp: lao màng phổi (TDMP, TKMP); lao bộ phận khác (lao màng não, xương, tiết niệu, hạch, v.v.).
2.3.1.3. Xquang phổị
* Hình ảnh Xquang phổi chuẩn: chụp Xquang phổi chuẩn khi bệnh nhân vào viện tại khoa Xquang, Bệnh viện Lao-Bệnh phổi Trung ương. Tiến hành ựọc phim theo phương pháp 2 người cùng ựọc, học viên cùng ựọc với cán bộ hướng dẫn. Xác ựịnh tổn thương theo phân loại tổn thương cơ bản của lao phổi mới thường gặp trên lâm sàng [57].
* Mô tả các hình thái tổn thương cơ bản.
- Tổn thương cơ bản của lao phổi là thâm nhiễm, nốt, hang.
Nốt: nốt mờ có ựường kắnh <10mm.
Thâm nhiễm: ựám mờ ựường kắnh từ 10mm trở lên.
Hang lao: hình sáng tròn hoặc trái xoan.
- Tổn thương phối hợp: tràn dịch màng phổi (TDMP), tràn khắ màng phổi (TKMP), dày dắnh màng phổi, v.v.
* Vị trắ tổn thương - Phổi phải, phổi tráị
- Vùng cao, vùng thấp [57].
Vùng thấp: tổn thương ở dưới ựường giới hạn ngang qua rốn phổi trên phim Xquang chuẩn thẳng, gồm có thuỳ dưới, thuỳ giữa và phân thuỳ lưỡị
Vùng cao: tổn thương nằm trên ựường giới hạn ngang qua rốn phổi trên phim Xquang chuẩn thẳng.
* Xác ựịnh mức ựộ tổn thương phổi theo phân loại của ATS (2000) chia làm 3 mức ựộ [75].
- độ I (diện hẹp): tổn thương không có hang, tổng diện tắch tổn thương ở một hoặc hai bên phổi nhưng không vượt quá một phân thuỳ phổị
- độ II (diện vừa): tổn thương ở một hoặc hai bên phổi, tổng diện tắch không vượt quá một thuỳ phổi, hoặc tổng diện tắch không vượt quá 1/3 thể tắch phổi, có thể có tổn thương hang nhưng tổng ựường kắnh các hang lao không vượt quá 4cm.
- độ III (diện rộng): tổng diện tắch tổn thương vượt quá một thuỳ phổi, nếu có hang thì tổng ựường kắnh hang > 4cm.
2.3.1.4. Một số xét nghiệm thường quỵ
* Phản ứng mantoux
Thực hiện tại khoa Vi sinh, Bệnh viện Lao-Bệnh phổi Trung ương.
- Kỹ thuật: tiêm 1/10ml dung dịch tuberculin PPD-S của Viện Paster Nha Trang vào trong da ở 1/3 mặt trước ngoài cẳng taỵ
- đọc và ựánh giá kết quả sau 72 giờ, ựo ựường kắnh của nốt sần, không tắnh kắch thước của quầng ựỏ xung quanh nốt sần [2]:
Âm tắnh: ựường kắnh của nốt sần <10mm. Dương tắnh: ựường kắnh của nốt sần ≥10mm.
* Soi ựờm tìm AFB bằng kỹ thuật nhuộm Ziehl - Neelssen
Phương pháp nhuộm nóng Ziehl-Neelsen, nhận ựịnh kết quả theo Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) như sau [10, 12, 68]:
* Âm tắnh (-): không có AFB/ ắt nhất 100 vi trường. * Dương tắnh (nAFB): 1 - 9 AFB/ 100 vi trường. * Dương tắnh (+): 10 - 99 AFB/100 vi trường. * Dương tắnh (++): 1 - 10 AFB/ 1 vi trường. * Dương tắnh (+++): > 10/ 1 vi trường.
* Xét nghiệm công thức máu
Các xét nghiệm công thức máu ựược tiến hành tại khoa Huyết học, Bệnh viện Lao-Bệnh phổi Trung ương. đánh giá các chỉ số huyết học dựa theo tiêu chuẩn phân loại Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương (1999) [29]; Beers M.H, Berkow R (1999) [86]
* Phân loại thiếu máu theo số lượng hồng cầu: - Thiếu máu nặng: số lượng hồng cầu < 2 triệụ - Thiếu máu vừa: số lượng hồng cầu từ 2-3 triệụ
- Thiếu máu nhẹ: số lượng hồng cầu từ trên 3-3,49 triệụ - Không thiếu máu: hồng cầu từ > 3,49 triệu
* Phân loại theo số lượng bạch cầu:
- Số lượng bạch cầu bình thường: 5.000-8.000/1mm3 - Giảm số lượng bạch cầu: < 5.000/1mm3
- Tăng số lượng bạch cầu: > 8.000/1mm3
Bảng 2.2. Công thức bạch cầu
Bạch cầu Giảm Bình thường Tăng
Bạch cầu ựa nhân trung tắnh < 60% 60 - 70 % >70 %
Bạch cầu lympho < 20% 20 - 30 % >30 %
* Xét nghiệm sinh hoá máu:
Xét nghiệm sinh hóa máu ựược thực hiện tại khoa Sinh hóa, Bệnh viện Lao- Bệnh phổi Trung ương: ựường máu, creatinin, protid, triglycerid, cholesterol, SGOT, SGPT. Kết quả ựường máu gồm 2 mức ựộ: 7mmol/l - <10mmol/l và >10mmol/l [6]. Một số chỉ số rối loạn chuyển hóa lipid máu ựánh giá theo ATPIII (2001) [6].
2.3.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu xét nghiệm miễn dịch
Xét nghiệm một số chỉ số miễn dịch ựược tiến hành cho 30 bệnh nhân nhóm lao phổi AFB(+) có bệnh đTđ, 30 bệnh nhân nhóm lao phổi AFB(+) không có bệnh đTđ và 30 người bình thường.
Bệnh phẩm là máu của bệnh nhân lấy lúc vào viện, khi chưa dùng thuốc và 30 mẫu máu của người bình thường.
Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm Mycobacteria, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
* Xét nghiệm ELISA xác ựịnh kháng thể IgA, IgG
* Nguyên lý: dùng kháng nguyên của VK lao ựể phát hiện kháng thể ựặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân lao [56].
Hình 2.1.Kỹ thuật ELISA xác ựịnh kháng thể IgA, IgG * Nguyên vật liệu, thiết bị:
- Máy ựọc ELISA Lp 400 của hãng SANOFI, có bước sóng 450nm, pipetman loại 20, 200 và 1000 ộl.
- Cộng hợp kháng huyết thanh dê kháng IgA, IgG người có gắn men peroxydaza (pha loãng 1/4000 trong PBS - Tween- BSA 1%) (Sigma, USA).
- Bản nhựa 96 tiếng ựáy phẳng (NUNC, Danmark).
- Dung dịch ựệm rửa bản: PBS-Tween 0,05%. Dung dịch cơ chất tetramethyl benzindine (TMB). Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 1N.
- Kháng nguyên: Tế bào VK lao siêu nghiền.
- Kháng thể: IgA, IgG ựặc hiệu kháng nguyên.
- Cộng hợp: Kháng thể của dê kháng
IgA/IgG người gắn enzym peroxydazạ
- Cơ chất: TMB.
- Kết quả trên máy ựọc ELISA ở bước sóng 450nm.
* Cách tiến hành:
- Phủ bản 96 giếng với kháng nguyên siêu nghiền M. tuberculosis: 50ộl kháng nguyên M. tuberculosis siêu nghiền (10ộg/1ml)/1 giếng, ủ ở 370C trong 1 giờ hoặc qua ựêm có nắp ựậỵ
- Sau khi rửa phiến 3 lần với dung dịch rửa PBS-Tween 0,05%, ủ với huyết thanh: 50ộl huyết thanh ựã pha loãng (1/400) trong PBS-Tween-BSA 1% vào mỗi giếng, ủ ở 370C trong 1 giờ, rửa bản 3 lần với PBS-Tween-BSA 0,05%.
- Ủ với cộng hợp: nhỏ 50ộl cộng hợp kháng huyết thanh dê kháng IgG hoặc IgA người ựã pha loãng (1/4000) bằng dung dịch ựệm PBS-Tween-BSA 1% vào mỗi giếng, ủ ở 370C/1h. Rửa bản 3 lần với PBS-Tween-BSA 0,05%.
- Ủ với cơ chất: cho 100ộl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ 15 phút ở 370C. Dừng phản ứng bằng H2SO41N (100ộl/giếng).
* đọc kết quả: trên máy ựọc ELISA ở bước sóng 450nm.
* đánh giá kết quả:
- Xác ựịnh giá trị OD trung bình tương ứng với IgA, IgG ựặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân lao phổi có đTđ hoặc bệnh nhân lao phổi không có đTđ và người bình thường.
- Xác ựịnh các tỷ lệ ựáp ứng IgA, IgG với kháng nguyên M. tuberculosis
siêu nghiền ở 3 nhóm nghiên cứụ
* Xét nghiệm IL-2 và TNF-αααα
* Nguyên lý: ELISA ỘsandwichỢ dùng kháng thể kháng ựặc hiệu IL-2 hoặc TNF-α người ựể phát hiện IL-2 hoặc TNF-α trong nước nổi nuôi cấy tế bào máu ngoại vị
Hình 2.2. Kỹ thuật ELISA ỘsandwichỢ xác ựịnh IL-2 hoặc TNF- α
Máu ngoại vi của bệnh nhân và người khoẻ mạnh ựược thu thập, pha loãng 1/10 và nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), kanamicin 0,1% ở ựiều kiện bổ sung và không bổ sung kháng nguyên M. tuberculosis siêu nghiền nồng ựộ 10ộg/ml. Ủ phiến nuôi cấy ở nhiệt ựộ 370C, CO2 5%. Nước nổi nuôi cấy tế bào ựược tách sau 24h và bảo quản tại -700C cho ựến khi phân tắch [87, 179]. Nồng ựộ các cytokin ựược ựo bằng kắt thương mại (R&D Systems và Amersham). độ nhạy phát hiện TNF-α và IL-2 lần lượt là 8ộg/ml và 5ộg/ml.
Quy trình xét nghiệm TNF-α:
Bước 1. Phủ bản với kháng thể tóm bắt.
* Pha loãng kháng thể tóm bắt với dung dịch PBS ở nồng ựộ 4ộg/ml. * Phủ bản với 100ộl/giếng, ựậy phiến và ủ qua ựêm ở nhiệt ựộ phòng. * Rửa bản 3 lần bằng dung dịch rửa (PBS, pH=7,2-7,4, Tween 20 0,05%). * Phong bế bằng PBS, pH 7,2-7,4, BSA 1% và sucrosa 5%.
* để khô ở nhiệt ựộ phòng. * Bảo quản ở 40C.
Mẫu chuẩn:
TNF-α: Pha loãng kháng thể với 1ml đ pha mẫu ựể có dung dịch mẹ 54ộg/ml, pha tiếp 180 lần ựể có nồng ựộ 310ng/ml.
- Kháng thể tóm bắt: kháng thể kháng ựặc hiệu IL-2 hoặc TNF-α người
- kháng thể phát hiện: kháng thể kháng ựặc hiệu IL-2 hoặc TNF-α người gắn biotin
- Cộng hợp: streptavidin gắn enzym peroxydazạ
- Cơ chất: TMB
Sử dụng dung dịch TNF-α 310ng/ml ựể pha loãng thành các mẫu chuẩn có nồng ựộ 1000pg/ml, 100pg/ml, 10pg/ml và 1pg/ml (chú ý: bảo quản các mẫu chuẩn ựã pha loãng ở -200C).
Bước 2. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 3. Ủ với huyết thanh bệnh nhân và mẫu chuẩn ựã pha loãng: 100ộl/giếng, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 2 giờ;
Bước 4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 5. Ủ với kháng thể phát hiện: 100ộl/ml, 2giờ ở nhiệt ựộ phòng; Bước 6. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 7. Ủ với cộng hợp gắn men streptavidin-HRP: 100ộl/giếng, 20 phút ở nhiệt ựộ phòng (trong chỗ tối) (pha loãng cộng hợp 1:200 lần với dung dịch pha mẫu);
Bước 8. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 9. Ủ với 100ộl cơ chất TMB trong 20 phút ở nhiệt ựộ phòng (trong chỗ tối), cho dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 2N (100ộl/giếng);
Bước 10. đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.
Quy trình xét nghiệm IL-2:
* Thành phần bộ kắt:
- Phiến polystyrene 96 giếng có gắn kháng thể kháng IL-2 của ngườị - Dung dịch kháng thể kháng IL-2 của người gắn biotin (V=8ml). - Dung dịch streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) ựậm ựặc (50ộl).