Xét nghiệm một số chỉ số miễn dịch ựược tiến hành cho 30 bệnh nhân nhóm lao phổi AFB(+) có bệnh đTđ, 30 bệnh nhân nhóm lao phổi AFB(+) không có bệnh đTđ và 30 người bình thường.
Bệnh phẩm là máu của bệnh nhân lấy lúc vào viện, khi chưa dùng thuốc và 30 mẫu máu của người bình thường.
Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm Mycobacteria, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
* Xét nghiệm ELISA xác ựịnh kháng thể IgA, IgG
* Nguyên lý: dùng kháng nguyên của VK lao ựể phát hiện kháng thể ựặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân lao [56].
Hình 2.1.Kỹ thuật ELISA xác ựịnh kháng thể IgA, IgG * Nguyên vật liệu, thiết bị:
- Máy ựọc ELISA Lp 400 của hãng SANOFI, có bước sóng 450nm, pipetman loại 20, 200 và 1000 ộl.
- Cộng hợp kháng huyết thanh dê kháng IgA, IgG người có gắn men peroxydaza (pha loãng 1/4000 trong PBS - Tween- BSA 1%) (Sigma, USA).
- Bản nhựa 96 tiếng ựáy phẳng (NUNC, Danmark).
- Dung dịch ựệm rửa bản: PBS-Tween 0,05%. Dung dịch cơ chất tetramethyl benzindine (TMB). Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 1N.
- Kháng nguyên: Tế bào VK lao siêu nghiền.
- Kháng thể: IgA, IgG ựặc hiệu kháng nguyên.
- Cộng hợp: Kháng thể của dê kháng
IgA/IgG người gắn enzym peroxydazạ
- Cơ chất: TMB.
- Kết quả trên máy ựọc ELISA ở bước sóng 450nm.
* Cách tiến hành:
- Phủ bản 96 giếng với kháng nguyên siêu nghiền M. tuberculosis: 50ộl kháng nguyên M. tuberculosis siêu nghiền (10ộg/1ml)/1 giếng, ủ ở 370C trong 1 giờ hoặc qua ựêm có nắp ựậỵ
- Sau khi rửa phiến 3 lần với dung dịch rửa PBS-Tween 0,05%, ủ với huyết thanh: 50ộl huyết thanh ựã pha loãng (1/400) trong PBS-Tween-BSA 1% vào mỗi giếng, ủ ở 370C trong 1 giờ, rửa bản 3 lần với PBS-Tween-BSA 0,05%.
- Ủ với cộng hợp: nhỏ 50ộl cộng hợp kháng huyết thanh dê kháng IgG hoặc IgA người ựã pha loãng (1/4000) bằng dung dịch ựệm PBS-Tween-BSA 1% vào mỗi giếng, ủ ở 370C/1h. Rửa bản 3 lần với PBS-Tween-BSA 0,05%.
- Ủ với cơ chất: cho 100ộl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ 15 phút ở 370C. Dừng phản ứng bằng H2SO41N (100ộl/giếng).
* đọc kết quả: trên máy ựọc ELISA ở bước sóng 450nm.
* đánh giá kết quả:
- Xác ựịnh giá trị OD trung bình tương ứng với IgA, IgG ựặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân lao phổi có đTđ hoặc bệnh nhân lao phổi không có đTđ và người bình thường.
- Xác ựịnh các tỷ lệ ựáp ứng IgA, IgG với kháng nguyên M. tuberculosis
siêu nghiền ở 3 nhóm nghiên cứụ
* Xét nghiệm IL-2 và TNF-αααα
* Nguyên lý: ELISA ỘsandwichỢ dùng kháng thể kháng ựặc hiệu IL-2 hoặc TNF-α người ựể phát hiện IL-2 hoặc TNF-α trong nước nổi nuôi cấy tế bào máu ngoại vị
Hình 2.2. Kỹ thuật ELISA ỘsandwichỢ xác ựịnh IL-2 hoặc TNF- α
Máu ngoại vi của bệnh nhân và người khoẻ mạnh ựược thu thập, pha loãng 1/10 và nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), kanamicin 0,1% ở ựiều kiện bổ sung và không bổ sung kháng nguyên M. tuberculosis siêu nghiền nồng ựộ 10ộg/ml. Ủ phiến nuôi cấy ở nhiệt ựộ 370C, CO2 5%. Nước nổi nuôi cấy tế bào ựược tách sau 24h và bảo quản tại -700C cho ựến khi phân tắch [87, 179]. Nồng ựộ các cytokin ựược ựo bằng kắt thương mại (R&D Systems và Amersham). độ nhạy phát hiện TNF-α và IL-2 lần lượt là 8ộg/ml và 5ộg/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quy trình xét nghiệm TNF-α:
Bước 1. Phủ bản với kháng thể tóm bắt.
* Pha loãng kháng thể tóm bắt với dung dịch PBS ở nồng ựộ 4ộg/ml. * Phủ bản với 100ộl/giếng, ựậy phiến và ủ qua ựêm ở nhiệt ựộ phòng. * Rửa bản 3 lần bằng dung dịch rửa (PBS, pH=7,2-7,4, Tween 20 0,05%). * Phong bế bằng PBS, pH 7,2-7,4, BSA 1% và sucrosa 5%.
* để khô ở nhiệt ựộ phòng. * Bảo quản ở 40C.
Mẫu chuẩn:
TNF-α: Pha loãng kháng thể với 1ml đ pha mẫu ựể có dung dịch mẹ 54ộg/ml, pha tiếp 180 lần ựể có nồng ựộ 310ng/ml.
- Kháng thể tóm bắt: kháng thể kháng ựặc hiệu IL-2 hoặc TNF-α người
- kháng thể phát hiện: kháng thể kháng ựặc hiệu IL-2 hoặc TNF-α người gắn biotin
- Cộng hợp: streptavidin gắn enzym peroxydazạ
- Cơ chất: TMB
Sử dụng dung dịch TNF-α 310ng/ml ựể pha loãng thành các mẫu chuẩn có nồng ựộ 1000pg/ml, 100pg/ml, 10pg/ml và 1pg/ml (chú ý: bảo quản các mẫu chuẩn ựã pha loãng ở -200C).
Bước 2. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 3. Ủ với huyết thanh bệnh nhân và mẫu chuẩn ựã pha loãng: 100ộl/giếng, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 2 giờ;
Bước 4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 5. Ủ với kháng thể phát hiện: 100ộl/ml, 2giờ ở nhiệt ựộ phòng; Bước 6. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 7. Ủ với cộng hợp gắn men streptavidin-HRP: 100ộl/giếng, 20 phút ở nhiệt ựộ phòng (trong chỗ tối) (pha loãng cộng hợp 1:200 lần với dung dịch pha mẫu);
Bước 8. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa;
Bước 9. Ủ với 100ộl cơ chất TMB trong 20 phút ở nhiệt ựộ phòng (trong chỗ tối), cho dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 2N (100ộl/giếng);
Bước 10. đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.
Quy trình xét nghiệm IL-2:
* Thành phần bộ kắt:
- Phiến polystyrene 96 giếng có gắn kháng thể kháng IL-2 của ngườị - Dung dịch kháng thể kháng IL-2 của người gắn biotin (V=8ml). - Dung dịch streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) ựậm ựặc (50ộl). - Dung dịch ựệm pha loãng streptavidin-HRP (14ml).
- Mẫu chuẩn IL-2, dạng tái tổ hợp ựông khô.
- Dung dịch ựệm pha loãng mẫu IL-2 chuẩn (12ml). - Dung dịch ựệm rửa ựậm ựặc 30 lần (50ml).
- Cơ chất tetramethyl benzidine (TMB) (12ml). - Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 0,18M. - Nắp dắnh ựể ựậy giếng.
* Chuẩn bị dung dịch
* đệm rửa: 50ml dung dịch ựậm ựặc pha trong 1450ml nước cất vô trùng. * Dung dịch streptavidin-HRP: 30ộl dung dịch streptavidin-HRP ựậm ựặc pha trong 12 ml dung dịch ựệm pha loãng streptavidin-HRP.
* Pha mẫu IL-2 chuẩn ở các nồng ựộ: 1500pg/ml, 600pg/ml, 240pg/ml, 96pg/ml, 38,4pg/ml, và 0 pg/ml (ựường cong chuẩn ựể ngoại suy nồng ựộ IL-2 có trong mẫu). Chỉ chuẩn bị khi bắt ựầu tiến hành thực nghiệm.
* Tiến hành thử nghiệm
* Cho 50ộl kháng thể gắn biotin vào mỗi giếng của phiến 96 giếng. * Cho 50ộl mẫu chuẩn hoặc mẫu nước nổi nuôi cấy vào các giếng. đậy phiến và ủ ở nhiệt ựộ phòng (20-250C) trong 3 giờ. Bỏ nước nổị Rửa phiến 3 lần bằng dung dịch rửạ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Cho 100ộl streptavidin-HRP vào mỗi giếng. đậy phiến và ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút. Bỏ nước nổị Rửa phiến 3 lần bằng dung dịch rửạ
* Cho 100ộl dung dịch cơ chất TMB vào mỗi giếng. đậy phiến và ủ ở nhiệt ựộ phòng (20-250C) (trong bóng tối) trong 30 phút.
* Cho 100ộl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. đo ựộ hấp thụ quang OD ở bước sóng 450nm.
* đánh giá kết quả
* Dựa vào giá trị OD của mẫu chuẩn ựể dựng ựường cong chuẩn theo phương pháp tuyến tắnh. Áp các giá trị OD của những mẫu kiểm tra lên ựường cong chuẩn ựể ngoại suy nồng ựộ.
- Xác ựịnh nồng ựộ IL-2 ựược tiết bởi tế bào máu ngoại vi của các ựối tượng thuộc 3 nhóm nghiên cứụ
- Xác ựịnh nồng ựộ TNF-α ựược tiết bởi tế bào máu ngoại vi của các ựối tượng thuộc 3 nhóm nghiên cứụ