CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.4. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase
2.4.5. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
❖ Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC- MS)
Trong nghiên cứu này thành phần hóa học của các hợp chất trong mẫu cao được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC-MS).
❖ Địa điểm thực hiện:
Mẫu được gửi phân tích tại Phịng thí nghiệm phân tích trung tâm – Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM.
2.5. Ứng dụng vào bảo quản tôm 2.5.1. Khảo sát nồng độ tối ưu 2.5.1. Khảo sát nồng độ tối ưu
❖ Quy trình bảo quản tơm:
Bước 1: Tôm nguyên liệu
Tôm dùng để nghiên cứu phải là tơm cịn tươi sống, vỏ ngun vẹn, cứng và sáng bóng, màu sắc đặc trưng, khơng bị đốm đen. Đầu dính chặt với mình, chân và đi cịn đầy đủ nguyên vẹn.
Bước 2: Rửa sạch
Mục đích: loại bỏ những bụi bẩn cũng như các mối nguy vật lý có thể tồn tại trên nguyên liệu.
Tôm sau khi tiếp nhận nhanh chóng rửa sạch, đảm bảo tơm sạch khơng làm ảnh hưởng đến q trình bảo quản.
Bước 3: Ướp đá
Tôm được đưa trực tiếp vào thùng chứa đá vảy và ướp đá trong vòng 1 giờ nhằm hạ nhiệt độ của tôm xuống đến 0oC làm tôm chết nhanh, giữ được độ tươi cho tôm.
Bước 4: Ngâm tôm
Nồng độ ngâm tôm trong dịch ngâm được thay đổi như sau: 0,0.1; 0,05 và 0,1% trong thời gian 15 phút. Dựa trên nghiên cứu của Kim và cộng sự (2000) tỉ lệ dịch ngâm: tôm 2:1, với tỷ lệ này sẽ khơng làm lỗng nồng độ dịch ngâm cũng như đảm bảo phủ lấp tồn bộ phần mặt tơm.
35
Bước 5: Để ráo, ướp đá và bảo quản
Sau q trình xử lý tơm được lấy ra khỏi dịch ngâm, để ráo. Tôm sẽ được lưu trữ trong túi zip. Sau đó tiến hành ướp tơm bằng đá vảy với một lớp đá một lớp tôm, nhiệt độ tôm khoảng 1-30C. Thời gian bảo quản trong 8 ngày, các mẫu sẽ được lấy ra để đánh giá melanosis trên tôm, sự gia tăng pH và chỉ số oxy hóa TBARS của tơm sau các ngày 0, 2, 4, 6, 8.
Hình 2.7: Quy trình bảo quản tơm 2.5.1.1.Thay đổi giá trị pH
Giá trị pH của tôm được xác định bằng phương pháp của M. E. Lo´pez-Caballero và cộng sự (2006). Thịt tôm (5-10 g) được nghiền nát và đồng nhất trong hóa nước cất với một lượng gấp đôi, hỗn hợp sau đồng nhất được giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Độ pH được xác định bằng máy đo pH (Seven easy pH, Trung Quốc).
2.5.1.2.Xác định chỉ số oxy hóa TBARS
❖ Nguyên tắc:
Phương pháp TBARS là một trong những phương pháp lâu đời nhất được sử dụng để đo lường q trình oxy hóa chất béo và lần đầu tiên được đề xuất vào những năm 1980 (Kishida và cộng sự, 1993, Shahidi và Wanasundara, 2002). Phương pháp này dựa trên sự hình thành phức màu hồng có độ hấp thu mạnh ở bước sóng 532-535nm khi acid thiobarbituric (TBA) phản ứng các sản phẩm oxy hóa thứ cấp từ các axit béo khơng no. Các sản phẩm oxy hóa thứ cấp của phản ứng thường được gọi là các chất phản ứng TBA, hoặc viết tắt là TBARS. Rửa sạch Ngâm Để ráo Tôm Ướp đá
Bảo quản 8 ngày Cao trích
Nước cất
36
❖ Quy trình
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình xử lý tơm và đo quang
❖ Giải thích quy trình:
Phối trộn: Cân chính xác 1g tơm đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm. Sau đó, cho 9mL dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA vào ống ly tâm.
Đun nóng và làm nguội: Hỗn hợp được đun nóng trong nước nóng 100 oC trong 10 phút, sau đó làm mát nhanh dưới vịi nước chảy.
Ly tâm: Hỗn hợp được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút.
Đo độ hấp thu quang: Dung dịch sau ly tâm thu nhận lớp trên và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 532nm bằng máy quang phổ UV/Vis.
TBARS được tính tốn dựa vào đường chuẩn của malonaldehyde (trong khoảng nồng độ 2 đến 10 ppm) và kết quả được biểu thị bằng mg malonaldehyde/kg thịt tôm.
2.5.1.3.Đánh giá melanosis trên tơm
❖ Phân tích hình ảnh:
Tơm được chụp lại bằng máy ảnh Canon EOS 60D có độ phân giải cao và thiết lập độ sáng cố định trong tất cả các hình. Kết quả thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm ImageJ (Image Processing and Analysis in Java). Giá trị độ xám (mean gray value) là tổng các giá
Xay nhuyễn Phối trộn Đun nóng Tôm Làm nguội Ly tâm
37
trị màu xám của toàn bộ pixel trong vùng lựa chọn chia cho số pixel. Các giá trị độ xám càng giảm biểu thị điểm biến đen hoặc sự phát triển của melanosis. Kết quả được áp dụng theo công thức của Angel B. Encarnacion (2011) với một vài hiệu chỉnh nhỏ:
% Thay đổi = 100 – [(A × 100)/B] (2.5)
Trong đó:
A: là giá trị độ xám trung bình thực tế của các mẫu tơm khảo sát tại các ngày 0, 2, 4, 6, 8. B: là giá trị độ xám trung bình của mẫu tơm đối chứng vào ngày 0.
2.5.2. Xác định chỉ tiêu vi sinh
Các mẫu tôm sau khi được bảo quản bằng dịch chiết bã vỏ điều với nồng độ tối ưu được tiến hành xác định các chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn kị khí khử Sulfite, và Pseudomonas.
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được xác định bằng tiêu chuẩn TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013). Vi khuẩn kị khí khử Sulfite được xác định bằng tiêu chuẩn NF V 08-061:2009. Và số lượng Pseudomonas được xác định bằng tiêu chuẩn TCVN 7138:2013 (ISO
13720:2010).
❖ Địa điểm thực hiện:
Mẫu được gửi phân tích tại Phịng thí nghiệm Upscience - Khu phố 1B, Phường An Phú, Thị Xã Thuận An, Tỉnh Bình Dương, Việt Nam
2.5.3. Xác định tổng lượng nitơ bazơ bay hơi TVB-N
Tổng lượng bazơ nitơ bay hơi - Total Volatile Basic Nitrogen (TVB-N) trong thịt tôm được xác định theo TCVN 9215:2012. Lượng TVB-N được biểu thị bằng mg N/100 g thịt tôm.
❖ Địa điểm thực hiện:
Mẫu được gửi phân tích tại Phịng thí nghiệm Upscience - Khu phố 1B, Phường An Phú, Thị Xã Thuận An, Tỉnh Bình Dương, Việt Nam
2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu được xử lý trên phần mềm SPSS 15.0 for Window Evaluation Version (IBM corporation, Armonk, North Castle, New York, U.S.A) để phân tích phương sai ANOVA và so sánh các trung bình được thực hiện theo kiểm nghiệm Tukey.
Phân tích hình ảnh bằng phần mềm ImageJ (Image Processing and Analysis in Java) (2012 version, National Institute of Health, USA)
38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Điều chế cao trích từ vỏ hạt điều
Dựa vào bảng kết quả 3.1 so sánh độ ẩm của 2 mẫu cao cho thấy 2 mẫu có độ ẩm khác nhau, tuy nhiên sự chênh lệch không quá cao. Đối với mẫu E-BD thu được ở dạng sệt có độ ẩm 4,76% cao hơn mẫu H-DD thu được ở dạng dầu lỏng có độ ẩm 3,78%. Sự khác nhau này là do dung mơi trích ly mẫu E-BD là dung mơi phân cực ethanol có thể trích ly một số thành phần chất béo có trong nguyên liệu, chất béo này có khả năng giữ ẩm, độ nhớt cao và làm cho mẫu có dạng sệt (Yan Li, 2014). Kết quả hiệu suất thu hồi của 2 mẫu cao được thể hiện trong bảng 3.1, thu suất của mẫu H-DD (21,5%) cao hơn mẫu E-BD (13,61%). Sự khác nhau về hiệu suất trích ly là do tính chất ngun liệu, loại dung mơi, tỷ lệ dung môi, nhiệt độ, thời gian và phương pháp trích ly. Mỗi loại nguyên liệu sẽ có hiệu suất trích ly khác nhau vì các chất trong mỗi nguyên liệu sẽ có khả năng hịa tan dung mơi khác nhau (Wang YC và cộng sự, 2008).
Bảng 3.1: Độ ẩm và hiệu suất của 2 mẫu cao
Tên mẫu Kí hiệu Độ ẩm (%) Hiệu suất thu hồi (%)
Bả vỏ điều E-BD 4,76 13,61
Dầu vỏ điều H-DD 3,78 21,5
Theo nghiên cứu của Sampson Kofi Kye và cộng sự (2019), độ ẩm và hiệu suất thu hồi của dầu vỏ hạt điều lần lượt là 4,45% và 30,61%. So sánh với kết quả thực nghiệm nhận thấy độ ẩm và hiệu suất của mẫu H-DD đều thấp hơn. Nguyên nhân có thể giải thích do độ ẩm ngun liệu ban đầu, dung mơi và phương pháp trích ly dầu. Trước khi trích ly, vỏ hạt điều đã qua quá trình sấy loại bỏ một phần ẩm trong vỏ hạt điều, ngồi ra cơ quay sau q trình trích ly để đuổi dung mơi có thể làm hao hụt lượng nước chứa trong dầu. Độ ẩm của cao thấp thuận lợi cho việc bảo quản cao vì tốc độ phát triển của vi sinh vật có mối tương quan với độ ẩm.
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của cao trích 3.2.1. Tổng hàm lượng phenolic 3.2.1. Tổng hàm lượng phenolic
Tổng hàm lượng phenolic của hai mẫu cao trích ly từ vỏ hạt điều được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Folin Ciocalteu được thể hiện trong bảng 3.2 dựa theo kết quả đo ở phụ lục 2b.
39
Bảng 3.2: Tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu cao vỏ hạt điều
Mẫu cao trích Tổng hàm lượng phenolic
(mg GAE/g vỏ hạt điều)
E-BD 306 ± 12
H-DD 34,6 ± 1,4
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3).
Kết quả thu được cho thấy tổng hàm lượng phenolic của hai mẫu cao có sự khác biệt đáng kể. Hàm lượng tổng phenolic của mẫu E-BD với giá trị là 306 ± 12 mg GAE/g cao gấp nhiều lần so với mẫu H-DD với giá trị 34,6 ± 1,4 mgGAE/g. Điều và các sản phẩm phụ từ điều đều chứa một lượng lớn phenolic. Vỏ hạt điều chứa thành phần polyphenol lớn (Tyman & Morris, 1967), dầu vỏ hạt điều chứa phần lớn thành phần là các hợp chất phenolic như acid anacadic, cardol và cardanol, đây lần lượt là các acid phenolic và phenolic lipid ( Bùi Văn Ái và Phan Thị Bích Ngọc, 2010). Giá trị tổng hàm lượng phenolic của mẫu E-BD khá cao, theo nghiên cứu của Neel Chandrasekara (2011), các lớp vỏ ngồi của thực vật có chứa hàm lượng phenolic cao hơn bên trong, đóng vai trị như chất bảo vệ chống lại mầm bệnh, ký sinh trùng, cũng như góp phần vào màu sắc và tính chất của thực vật. Các thành phần khác như lá điều hay vỏ lụa hạt điều đều chứa hàm lượng phenolic rất lớn, lần lượt là 269,05 mgGAE/g (Tan, Y. P., 2014) và 187,37 mgGAE/g (Mạc Xn Hịa, 2018). Ngồi ra, các thành phần xơ của điều cũng cho thấy lượng phenolic tổng rất cao. Dung mơi chiết cũng đóng vai trị lớn đối với hiệu suất trích ly phenolic. Hầu hết các dẫn xuất acid phenolic của tế bào thực vật nằm trong không bào và thường được chiết xuất với các dung mơi có chứa alcohol hoặc dung môi hữu cơ. Nawaz và cộng sự (2005) đã báo cáo rằng sử dụng ethanol làm dung môi chiết là một phương pháp trích ly polyphenol hiệu quả từ hạt nho và bằng cách sử dụng phương pháp này, có thể thu được lượng polyphenol tối đa.
3.2.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Theo Sousa và cộng sự (2007), chất chống oxy hóa là các chất mà khi tồn tại với nồng độ thấp cũng sẽ làm chậm hoặc ức chế một cách đáng kể quá trình oxy hóa. Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH là phương pháp có tính chất đơn giản, được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các chất chiết xuất từ thực vật. Phương pháp này đang bắt đầu được sử dụng nhiều đặc biệt trong việc sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa. Có đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxy hóa đã sử dụng phép phân tích này (Joon-Kwan và Takayuki, 2009).
40
Các thông số sau khi đo đạc đã được xử lý thống kê. Kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa được thể hiện qua giá trị phần trăm ức chế trung bình và giá trị IC50 của 2 mẫu cao được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Phần trăm ức chế (I%) và giá trị IC50 của các 2 mẫu cao
Mẫu % Ức chế gốc tự do (I%) IC50
µg/mL E-BD 10 µg/mL 5 µg/mL 2.5 µg/mL 1 µg/mL 83,95 ± 0,80d 52,30± 0,61c 29,48 ± 0,85b 11,33 ± 1,12a 5,35 H-DD 100 µg/mL 50 µg/mL 25 µg/mL 10 µg/mL 18,36 ± 0,51d 7,96 ± 0,73c 6,65 ± 0,56b 1,46 ± 0,14a >100
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-d) thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về giá trị ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Nhìn chung, hoạt tính ức chế gốc tự do ở từng nồng độ của 2 mẫu cao có sự khác biệt đáng kể (p ≤ 0,05). Khi nồng độ tăng dần thì phần trăm ức chế gốc tự do cũng tăng dần, chứng tỏ khả năng kháng oxy hóa của các mẫu cao tỉ lệ thuận với chiều tăng nồng độ. Dựa vào bảng kết quả, đối với mẫu E-BD ở nồng độ 5 và 10 µg/mL có phần trăm ức chế gốc tự do cao hơn 50% còn đối với mẫu H-DD dù tăng nồng độ lên gấp 10 so với mẫu E-BD nhưng ở cả 4 nồng độ phần trăm ức chế gốc tự do đều thấp hơn 50%. Giá trị IC50 càng thấp thì khả năng kháng oxy hóa càng cao. Từ kết quả thử nghiệm cho thấy rằng, mẫu E-BD có giá trị IC50 thấp hơn (IC50 = 5,35 µg/mL) so với mẫu H-DD (IC50 >100 µg/mL) chứng tỏ mẫu E- BD có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn, hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu H-DD yếu hầu như khơng có khả năng ức chế gốc tự do. Theo Necla Öztaşkın và cộng sự (2015) cho rằng khả năng cho hydrogen của nhóm hydroxyl gắn trên vịng thơm quyết định cơ chế kháng gốc tự do của hợp chất phenol và khả năng kháng gốc tự do được ưu tiên hơn khi nhóm -OH được gắn tại vị trí -orto. Mẫu H-DD chủ yếu chứa các steroid, acid béo nên khơng có khả năng cho proton linh động. Do đó, mẫu H-DD khơng thể hiện hoạt tính ức chế DPPH.
Khi so sánh với chất đối chứng dương là acid gallic có giá trị IC50 là 5,62 µg/ml thì mẫu E-BD có giá trị IC50 thấp hơn. Có thể thấy, mẫu E-BD có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn (Bảng 3.4)
41
Bảng 3.4: Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, acid gallic
Mẫu % Ức chế gốc tự do (I%) IC50
µg/mL
Acid gallic 10 µg/mL 5 µg/mL 2.5 µg/mL 1 µg/mL
70,18 ± 1,10 52,46 ± 0,80 34,56 ± 1,85 20,35 ± 0,80 5,62
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=3)
Theo nghiên cứu của Prakash A và cộng sự (2018) về đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của các phụ phẩm nông nghiệp (vỏ hạt điều, vỏ dừa, vỏ đậu phộng) chỉ ra rằng vỏ hạt điều có giá trị IC50 = 44 µg/mL. So sánh với kết quả mẫu E-BD cho thấy mẫu E-BD có khả năng kháng oxy hóa cao hơn cao gấp 8 lần so với trích vỏ hạt điều được trích ly từ dung mơi methanol của nghiên cứu Prakash A. Qua đó cho thấy, mẫu E-BD có khả năng ức chế gốc tự do thể hiện tính kháng oxy hóa của mẫu.
3.2.3. Xác định năng lực khử
Quá trình khử thường được dùng để chỉ thị khả năng nhường electron của chất chống oxy hóa khi tham gia vào phản ứng oxy hóa – khử. Đánh giá năng lực khử cho phép đánh giá sơ bộ được khả năng chống oxy hóa của một chất.
Các thông số sau khi đo đạc được xử lý thống kê. Kết quả nghiên cứu hoạt tính khử của 2 mẫu cao được trình bài trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khả năng khử Fe3+ của 2 mẫu cao
Mẫu
Độ hấp thu tại các nồng độ EC50
mg/mL
0,1 mg/mL 0,25 mg/mL 0,5 mg/mL 1 mg/mL
E-BD 0,532 ± 0,018a 1,327 ± 0,064b 2,915 ± 0,043c - 0.10 H-DD 0,169 ± 0,012a - 0,739 ± 0,011b 1,258 ± 0,069c 0.35
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-c) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về giá trị năng lực khử của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Từ bảng số liệu thấy rằng, theo chiều tăng nồng độ giá trị mật độ quang OD của 2 mẫu cao trích tăng dần, cho thấy có sự khác biệt đáng kể có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,05). Độ hấp thu cao hơn cho thấy khả năng khử lớn hơn của mẫu. Do đó, nồng độ càng cao thì năng lực khử và khả năng kháng oxy hóa càng mạnh. Dựa vào bảng kết quả, mẫu H-