STT Phương pháp thử Phương pháp kiểm
nghiệm Thông số đánh giá
1 Xác định tổng hàm lượng
Nitơ bazơ bay hơi (TVBN) TCVN 9215:2012
Biểu thị bằng mg N/100 g thịt tôm 2 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí TCVN 4884-1:2015 /ISO 4833-1:2013 Tổng vi sinh vật (CFU/g) 3 Định lượng vi khuẩn kỵ khí khử Sulfite NF V 08-061:2009 4 Định lượng Pseudomonas aeruginosa TCVN 7138:2013 /ISO 13720:2010 Tổng vi sinh vật (CFU/g)
28
Địa điểm thực hiện: Thử nghiệm được thực hiện tại Upscience labs solutions - Khu
phố 1B, Phường An Phú, Thị Xã Thuận An, Tỉnh Bình Dương, Việt Nam
2.4. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase 2.4.1. Xác định tổng hàm lượng polyphenol 2.4.1. Xác định tổng hàm lượng polyphenol
❖ Nguyên tắc:
Polyphenol từ dầu vỏ điều và từ mẫu cao trích (cịn một lượng nhỏ dung mơi) được chiết bằng methanol 70% ở 70oC. Sau đó dung dịch chiết thu được sẽ phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu trong môi trường kiềm. Thuốc thử sẽ oxy hoá các hợp chất polyphenol tạo ra các acid heteroply màu xanh da trời có hấp thu bước sóng cực đại ở 760nm bằng thiết bị UH5300 UV/Vis) (TCVN 9745).
❖ Quy trình:
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình xác định tổng hàm lượng polyphenol
❖ Giải thích quy trình:
Quy trình xác định tổng polyphenol trong cao trích bằng phương pháp so màu với thuốc thử FOLIN-CIOCALTEU theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745-1:2013.
29
Chiết polyphenol: Cân chính xác 0.200g mẫu cho vào ống chiết thuỷ tinh. Cho 10,0mL hỗn hợp dịch chiết nóng MeOH:H2O (7:3) vào ống chiết, đậy nắp và trộn trên máy trộn vortex. Đun nóng ống chiết 10 phút trong bể điều nhiệt 70oC, sau 5 phút vortex một lần. Pha loãng mẫu: Mẫu thử sẽ được pha lỗng ở hệ số pha lỗng thích hợp tùy vào nồng độ polyphenol. Đối với mẫu cao dầu, mẫu được pha loãng đến nồng độ 500 µg /ml và đối với mẫu cao trích bằng Ethanol, mẫu được pha lỗng đến nồng độ 50 µg /ml.
Lên màu: Rút 1,3ml dung dịch chiết đã pha lỗng vào ống thủy tinh. Sau đó cho thêm 1ml thuốc thử FC 20%, lắc đều và để yên trong 3 phút. Tiếp theo, cho thêm 0,7ml Na2CO3 10% vào ống nghiệm, lắc đều và ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phịng.
Mẫu trắng được thực hiện tương tự nhưng thay thể tích mẫu bằng cùng thể tích nước cất.
Cuối cùng đem mẫu đi đo độ hấp thu ở bước sóng 760nm trong cuvette thủy tinh có chiều dài đường quang 10mm bằng thiết bị UV/Vis.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Nội suy hàm lượng tổng polyphenol trong dung dịch mẫu từ đường tuyến tính.
Hàm lượng polyphenol tổng số theo % chất khơ được tính dựa vào đường chuẩn của acid gallic trong khong nng 1 ữ 20 àg/mL theo công thức:
𝑿 =𝑪. 𝟏𝟎. 𝑭
𝒎 (𝒎𝒈 𝑮𝑨𝑬/𝒈 𝒎ẫ𝒖 𝒌𝒉ô ) (2.2)
Trong đó:
X : Hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu quy về lượng tương đương với chất chuẩn acid gallic, mg GAE/g mẫu khô.
C : Nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn của acid gallic, mg/ml F : hệ số pha loãng (từ dung dịch đã chiết 10mL)
m: khối lượng cân của mẫu, g.
2.4.2. Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
❖ Nguyên tắc:
Dựa trên phản ứng khử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy (DPPH) thành 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazin (DPPH - H). DPPH là một gốc tự do bền nhờ sự di chuyển bất định của cặp electron tự do trong phân tử, có màu tím khơng tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Dưới tác động của chất oxy hóa AH sẽ cho 1 nguyên tử H và DPPH bị khử thành DPPH-H, dung dịch DPPH màu tím sẽ chuyển sang màu vàng của DPPH-H (Hoàng Thị Phương Liên,
30
2018). Giá trị mật độ quang OD càng thấp thì khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (W. Brand-Williams và cộng sự, 1995).
Hình 2.4: Diphenylpicrylhydrazyl và Diphenylpicrylhydrazine
❖ Quy trình thực hiện
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
❖ Thuyết minh sơ đồ:
Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH xác định theo phương pháp (Fu, H. Y. và Shieh, D. E., 2002) với một số hiệu chỉnh cho phù hợp với bài thí nghiệm.
Hịa tan 0,003g mẫu cao với 6mL EtOH 96% để mẫu có nồng độ 500µg/mL
Tiếp tục pha lỗng mẫu có nồng độ 500µg/mL với EtOH 96% để được 4 nồng độ khác nhau, sau đó thêm 1500µL DPPH 100µg/mL vào 1500µL mẫu thử ở các nồng độ trên. (i) Mẫu dầu được pha loãng ở nồng độ 100; 50; 25; 10µg/mL với 3 lần lặp và (ii) Mẫu cao ethanol thử ở nồng độ 10; 5; 2; 1µg/mL với 3 lần lặp. EtOH DPPH Hòa tan Phối trộn EtOH Ủ 30 phút
Đo độ hấp thu bước sóng 517 nm Mẫu cao
31
Ủ: để yên hỗn hợp trong điều kiện khơng có ánh sáng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo độ hấp thu quang ở bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ hồng ngoại khả kiến. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu.
Với mỗi nồng độ mẫu thử ta chuẩn bị một mẫu blank để so sánh, các mẫu blank sẽ cho EtOH mà không cho DPPH và được thay thế bằng lượng tương ứng. Mẫu control được thực hiện tương tự nhưng thay mẫu cao bằng EtOH 96%.
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Acid gallic là chất có hoạt tính ức chế mạnh gốc tự do DPPH nên được dùng làm chất đối chứng dương trong thí nghiệm này. Acid gallic được pha theo nồng độ 10; 5; 2,5; và 1 µg/mL.
Tỷ lệ (%) cứ chế hoạt động được tính tốn từ công thức sau (Mannan, M. A., 2017):
𝑰 (%) =𝑨𝑪− 𝑨𝑺
𝑨𝑪 × 𝟏𝟎𝟎% (2.3)
Trong đó:
AC : Giá trị mật độ quang của dung dịch khơng có mẫu cao (control – mẫu đối chứng) AS : Giá trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
Mẫu control: Ta thay Vmẫu bằng VEtOH
Mẫu blank: Được chuẩn bị tương tự mẫu sample nhưng ta thay VDPPH bằng VEtOH
❖ Xác định IC50
Từ tỉ lệ phần trăm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, ta xây dựng phương trình tương quan tuyến tính, từ đó xác định IC50 – là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH hoặc enzyme để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các mẫu. Mẫu có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ ta sẽ vẽ một đường thẳng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 qua tất cả các điểm. Với những mẫu có hoạt tính khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (với y là % ức chế, 𝑥 là nồng độ). Từ đó, ta thu được phương trình 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 với 2 hệ số a, b đã biết.
Thay y= 50 vào phương trình ta sẽ tìm được giá trị 𝑥 với 𝑥 là nồng độ ức chế 50% gốc tự do.
2.4.3. Xác định năng lực khử
32
Hoạt tính kháng oxy hóa của cao trích vỏ hạt điều được xác định dựa trên khả năng khử Fe3+ trong phức [Fe(CN)6]3- thành Fe2+ trong phức [Fe(CN)6]4- khi có mặt của chất kháng oxy hóa, sau đó phức [Fe(CN)6]4- tiếp tục phản ứng với Fe3+ trong FeCl3 để tạo thành phức Fe[Fe(CN6)]- có màu xanh được đo ở bước sóng 700 nm (Phan Kim Định, 2017). Độ hấp thu cao hơn cho thấy khả năng khử lớn hơn của mẫu.
❖ Quy trình:
Hình 2.6: Sơ đồ quy trình xác định khả năng khử
❖ Giải thích quy trình:
Quy trình xác định khả năng khử của cao trích được tiến hành theo phương pháp của Bhalodia (2013) với một số hiệu chỉnh cho phù hợp với bài thí nghiệm.
Phối trộn: Chuẩn bị cao trích ở các nồng độ 0,1; 0,25; 0,5 và 1mg/mL sau đó phối trộn 1mL mẫu ở mỗi nồng độ với 2,5 mL đệm phosphate 0,2 M, pH 6,6 và 2,5 mL Kali ferricyanide 1%.
Ủ: Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong 20 phút.
Phối trộn: thêm vào 2,5 mL acid trichloroacetic 10% vào hỗn hợp trên, lắc đều hỗn hợp. 1 mL Cao trích nồng độ 0,1; 0,25; 0,5 và 1 mg/mL 2,5 mL đệm phosphate 2M, pH 6.6 2,5 mL potassium ferriccyanide Phối trộn Ủ Phối trộn Ly tâm Phối trộn Đo mật độ quang ở 700 nm 2,5 mL acid trichloroacetic (TCA) 10% 2 mL nước cất 0,4 mL ferric chloride 0,1%
33
Ly tâm: ly tâm hỗn hợp dung dịch với tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút bằng thiết bị ly tâm.
Phối trộn: phối trộn 2mL lớp trên của dung dịch sau ly tâm với 2mL nước cất và 0,4mL ferric chloride 0,1%.
Mẫu trắng được thực hiện tương tự nhưng thay thể tích mẫu bằng cùng thể tích nước cất.
Cuối cùng đem mẫu đi đo độ hấp thu ở bước sóng 700nm trong cuvette thủy tinh có chiều dài đường quang 10mm bằng thiết bị UV/Vis.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả tính tốn giá trị EC50 là nồng độ dịch chiết cho độ hấp thu quang là 0,5.
2.4.4. Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
❖ Nguyên tắc
L-tyrosine được sử dụng làm cơ chất trong thử nghiệm thử hoạt tính ức chế sự hoạt động của enzym tyrosinase. Enzyme tyrosinase sẽ chuyển hóa L-tyrosine thành dopachrome có màu đỏ cam và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax = 475nm (Jae Kyung No,1999). Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế khi cho vào dung dịch đo quang sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme tyrosinase. Khi đó q trình chuyển hóa L-tyrosine thành dopachrome cũng sẽ giảm dẫn đến cường độ màu sẽ bị giảm đi (Đặng Hồng Phú, 2019).
❖ Quy trình thực hiện
Hoạt tính tyrosinase được xác định dựa trên phương pháp trắc quang để đo mật độ quang của enzyme tyrosinase. Phần trăm ức chế được tính như sau:
𝐏𝐡ầ𝐧 𝐭𝐫ă𝐦 ứ𝐜 𝐜𝐡ế (%) =𝐀 − 𝐁
𝐀 𝐱𝟏𝟎𝟎 (2.4)
Trong đó:
A – Hoạt tính PPO của mẫu đối chứng B – Hoạt tính PPO trong dịch chiết
Acid kojic được sử dụng như chất đối chứng dương.
❖ IC50
IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó 50% hoạt tính của PPO bị ức chế. Giá trị IC50 (µg/ml) được tính tốn dựa vào phần trăm ức chế tương ứng. Từ giá trị phần trăm ức chế PPO tương ứng với mỗi nồng độ cao trích/ chất chuẩn đã tìm được ở trên, ta
34
dựng một đồ thị tương quan giữa phần trăm ức chế và nồng độ cao trích/ chất chuẩn. Từ đó tìm được giá trị IC50 (µg/ml) cho mỗi cao trích.
❖ Địa điểm thực hiện:
Mẫu được gửi phân tích tại Phịng thí nghiệm Nghiên cứu và Phát triển Hóa dược, Trung tâm nghiên cứu và chuyển giao công nghệ thuộc Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.4.5. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
❖ Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC- MS)
Trong nghiên cứu này thành phần hóa học của các hợp chất trong mẫu cao được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC-MS).
❖ Địa điểm thực hiện:
Mẫu được gửi phân tích tại Phịng thí nghiệm phân tích trung tâm – Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM.
2.5. Ứng dụng vào bảo quản tôm 2.5.1. Khảo sát nồng độ tối ưu 2.5.1. Khảo sát nồng độ tối ưu
❖ Quy trình bảo quản tơm:
Bước 1: Tơm ngun liệu
Tôm dùng để nghiên cứu phải là tơm cịn tươi sống, vỏ ngun vẹn, cứng và sáng bóng, màu sắc đặc trưng, khơng bị đốm đen. Đầu dính chặt với mình, chân và đi cịn đầy đủ nguyên vẹn.
Bước 2: Rửa sạch
Mục đích: loại bỏ những bụi bẩn cũng như các mối nguy vật lý có thể tồn tại trên ngun liệu.
Tơm sau khi tiếp nhận nhanh chóng rửa sạch, đảm bảo tơm sạch không làm ảnh hưởng đến q trình bảo quản.
Bước 3: Ướp đá
Tơm được đưa trực tiếp vào thùng chứa đá vảy và ướp đá trong vòng 1 giờ nhằm hạ nhiệt độ của tôm xuống đến 0oC làm tôm chết nhanh, giữ được độ tươi cho tôm.
Bước 4: Ngâm tôm
Nồng độ ngâm tôm trong dịch ngâm được thay đổi như sau: 0,0.1; 0,05 và 0,1% trong thời gian 15 phút. Dựa trên nghiên cứu của Kim và cộng sự (2000) tỉ lệ dịch ngâm: tôm 2:1, với tỷ lệ này sẽ khơng làm lỗng nồng độ dịch ngâm cũng như đảm bảo phủ lấp tồn bộ phần mặt tơm.
35
Bước 5: Để ráo, ướp đá và bảo quản
Sau q trình xử lý tơm được lấy ra khỏi dịch ngâm, để ráo. Tôm sẽ được lưu trữ trong túi zip. Sau đó tiến hành ướp tơm bằng đá vảy với một lớp đá một lớp tôm, nhiệt độ tôm khoảng 1-30C. Thời gian bảo quản trong 8 ngày, các mẫu sẽ được lấy ra để đánh giá melanosis trên tôm, sự gia tăng pH và chỉ số oxy hóa TBARS của tơm sau các ngày 0, 2, 4, 6, 8.
Hình 2.7: Quy trình bảo quản tơm 2.5.1.1.Thay đổi giá trị pH
Giá trị pH của tôm được xác định bằng phương pháp của M. E. Lo´pez-Caballero và cộng sự (2006). Thịt tôm (5-10 g) được nghiền nát và đồng nhất trong hóa nước cất với một lượng gấp đơi, hỗn hợp sau đồng nhất được giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Độ pH được xác định bằng máy đo pH (Seven easy pH, Trung Quốc).
2.5.1.2.Xác định chỉ số oxy hóa TBARS
❖ Nguyên tắc:
Phương pháp TBARS là một trong những phương pháp lâu đời nhất được sử dụng để đo lường q trình oxy hóa chất béo và lần đầu tiên được đề xuất vào những năm 1980 (Kishida và cộng sự, 1993, Shahidi và Wanasundara, 2002). Phương pháp này dựa trên sự hình thành phức màu hồng có độ hấp thu mạnh ở bước sóng 532-535nm khi acid thiobarbituric (TBA) phản ứng các sản phẩm oxy hóa thứ cấp từ các axit béo khơng no. Các sản phẩm oxy hóa thứ cấp của phản ứng thường được gọi là các chất phản ứng TBA, hoặc viết tắt là TBARS. Rửa sạch Ngâm Để ráo Tôm Ướp đá
Bảo quản 8 ngày Cao trích
Nước cất
36
❖ Quy trình
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình xử lý tơm và đo quang
❖ Giải thích quy trình:
Phối trộn: Cân chính xác 1g tơm đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm. Sau đó, cho 9mL dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA vào ống ly tâm.
Đun nóng và làm nguội: Hỗn hợp được đun nóng trong nước nóng 100 oC trong 10 phút, sau đó làm mát nhanh dưới vịi nước chảy.
Ly tâm: Hỗn hợp được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút.
Đo độ hấp thu quang: Dung dịch sau ly tâm thu nhận lớp trên và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 532nm bằng máy quang phổ UV/Vis.
TBARS được tính tốn dựa vào đường chuẩn của malonaldehyde (trong khoảng nồng độ 2 đến 10 ppm) và kết quả được biểu thị bằng mg malonaldehyde/kg thịt tơm.
2.5.1.3.Đánh giá melanosis trên tơm
❖ Phân tích hình ảnh:
Tơm được chụp lại bằng máy ảnh Canon EOS 60D có độ phân giải cao và thiết lập độ sáng cố định trong tất cả các hình. Kết quả thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm ImageJ (Image Processing and Analysis in Java). Giá trị độ xám (mean gray value) là tổng các giá
Xay nhuyễn Phối trộn Đun nóng Tơm Làm nguội Ly tâm
37
trị màu xám của toàn bộ pixel trong vùng lựa chọn chia cho số pixel. Các giá trị độ xám càng giảm biểu thị điểm biến đen hoặc sự phát triển của melanosis. Kết quả được áp dụng theo công thức của Angel B. Encarnacion (2011) với một vài hiệu chỉnh nhỏ:
% Thay đổi = 100 – [(A × 100)/B] (2.5)
Trong đó:
A: là giá trị độ xám trung bình thực tế của các mẫu tơm khảo sát tại các ngày 0, 2, 4, 6, 8. B: là giá trị độ xám trung bình của mẫu tơm đối chứng vào ngày 0.
2.5.2. Xác định chỉ tiêu vi sinh
Các mẫu tôm sau khi được bảo quản bằng dịch chiết bã vỏ điều với nồng độ tối ưu được tiến hành xác định các chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn kị khí khử Sulfite, và Pseudomonas.
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được xác định bằng tiêu chuẩn TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013). Vi khuẩn kị khí khử Sulfite được xác định bằng tiêu chuẩn NF V 08-061:2009. Và số lượng Pseudomonas được xác định bằng tiêu chuẩn TCVN 7138:2013 (ISO
13720:2010).
❖ Địa điểm thực hiện:
Mẫu được gửi phân tích tại Phịng thí nghiệm Upscience - Khu phố 1B, Phường An