CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.4. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase
2.4.2. Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
❖ Nguyên tắc:
Dựa trên phản ứng khử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy (DPPH) thành 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazin (DPPH - H). DPPH là một gốc tự do bền nhờ sự di chuyển bất định của cặp electron tự do trong phân tử, có màu tím khơng tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Dưới tác động của chất oxy hóa AH sẽ cho 1 nguyên tử H và DPPH bị khử thành DPPH-H, dung dịch DPPH màu tím sẽ chuyển sang màu vàng của DPPH-H (Hoàng Thị Phương Liên,
30
2018). Giá trị mật độ quang OD càng thấp thì khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (W. Brand-Williams và cộng sự, 1995).
Hình 2.4: Diphenylpicrylhydrazyl và Diphenylpicrylhydrazine
❖ Quy trình thực hiện
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
❖ Thuyết minh sơ đồ:
Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH xác định theo phương pháp (Fu, H. Y. và Shieh, D. E., 2002) với một số hiệu chỉnh cho phù hợp với bài thí nghiệm.
Hịa tan 0,003g mẫu cao với 6mL EtOH 96% để mẫu có nồng độ 500µg/mL
Tiếp tục pha lỗng mẫu có nồng độ 500µg/mL với EtOH 96% để được 4 nồng độ khác nhau, sau đó thêm 1500µL DPPH 100µg/mL vào 1500µL mẫu thử ở các nồng độ trên. (i) Mẫu dầu được pha loãng ở nồng độ 100; 50; 25; 10µg/mL với 3 lần lặp và (ii) Mẫu cao ethanol thử ở nồng độ 10; 5; 2; 1µg/mL với 3 lần lặp. EtOH DPPH Hòa tan Phối trộn EtOH Ủ 30 phút
Đo độ hấp thu bước sóng 517 nm Mẫu cao
31
Ủ: để yên hỗn hợp trong điều kiện khơng có ánh sáng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo độ hấp thu quang ở bước sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ hồng ngoại khả kiến. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu.
Với mỗi nồng độ mẫu thử ta chuẩn bị một mẫu blank để so sánh, các mẫu blank sẽ cho EtOH mà không cho DPPH và được thay thế bằng lượng tương ứng. Mẫu control được thực hiện tương tự nhưng thay mẫu cao bằng EtOH 96%.
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Acid gallic là chất có hoạt tính ức chế mạnh gốc tự do DPPH nên được dùng làm chất đối chứng dương trong thí nghiệm này. Acid gallic được pha theo nồng độ 10; 5; 2,5; và 1 µg/mL.
Tỷ lệ (%) cứ chế hoạt động được tính tốn từ công thức sau (Mannan, M. A., 2017):
𝑰 (%) =𝑨𝑪− 𝑨𝑺
𝑨𝑪 × 𝟏𝟎𝟎% (2.3)
Trong đó:
AC : Giá trị mật độ quang của dung dịch khơng có mẫu cao (control – mẫu đối chứng) AS : Giá trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
Mẫu control: Ta thay Vmẫu bằng VEtOH
Mẫu blank: Được chuẩn bị tương tự mẫu sample nhưng ta thay VDPPH bằng VEtOH
❖ Xác định IC50
Từ tỉ lệ phần trăm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, ta xây dựng phương trình tương quan tuyến tính, từ đó xác định IC50 – là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH hoặc enzyme để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các mẫu. Mẫu có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ ta sẽ vẽ một đường thẳng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 qua tất cả các điểm. Với những mẫu có hoạt tính khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến hành vẽ đường thẳng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (với y là % ức chế, 𝑥 là nồng độ). Từ đó, ta thu được phương trình 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 với 2 hệ số a, b đã biết.
Thay y= 50 vào phương trình ta sẽ tìm được giá trị 𝑥 với 𝑥 là nồng độ ức chế 50% gốc tự do.