❖ Giải thích quy trình:
Quy trình xác định tổng polyphenol trong cao trích bằng phương pháp so màu với thuốc thử FOLIN-CIOCALTEU theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745-1:2013.
29
Chiết polyphenol: Cân chính xác 0.200g mẫu cho vào ống chiết thuỷ tinh. Cho 10,0mL hỗn hợp dịch chiết nóng MeOH:H2O (7:3) vào ống chiết, đậy nắp và trộn trên máy trộn vortex. Đun nóng ống chiết 10 phút trong bể điều nhiệt 70oC, sau 5 phút vortex một lần. Pha loãng mẫu: Mẫu thử sẽ được pha lỗng ở hệ số pha lỗng thích hợp tùy vào nồng độ polyphenol. Đối với mẫu cao dầu, mẫu được pha lỗng đến nồng độ 500 µg /ml và đối với mẫu cao trích bằng Ethanol, mẫu được pha lỗng đến nồng độ 50 µg /ml.
Lên màu: Rút 1,3ml dung dịch chiết đã pha lỗng vào ống thủy tinh. Sau đó cho thêm 1ml thuốc thử FC 20%, lắc đều và để yên trong 3 phút. Tiếp theo, cho thêm 0,7ml Na2CO3 10% vào ống nghiệm, lắc đều và ủ trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phịng.
Mẫu trắng được thực hiện tương tự nhưng thay thể tích mẫu bằng cùng thể tích nước cất.
Cuối cùng đem mẫu đi đo độ hấp thu ở bước sóng 760nm trong cuvette thủy tinh có chiều dài đường quang 10mm bằng thiết bị UV/Vis.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. Nội suy hàm lượng tổng polyphenol trong dung dịch mẫu từ đường tuyến tính.
Hàm lượng polyphenol tổng số theo % chất khơ được tính dựa vào đường chuẩn của acid gallic trong khong nng 1 ữ 20 àg/mL theo công thức:
𝑿 =𝑪. 𝟏𝟎. 𝑭
𝒎 (𝒎𝒈 𝑮𝑨𝑬/𝒈 𝒎ẫ𝒖 𝒌𝒉ô ) (2.2)
Trong đó:
X : Hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu quy về lượng tương đương với chất chuẩn acid gallic, mg GAE/g mẫu khơ.
C : Nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn của acid gallic, mg/ml F : hệ số pha loãng (từ dung dịch đã chiết 10mL)
m: khối lượng cân của mẫu, g.
2.4.2. Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
❖ Nguyên tắc:
Dựa trên phản ứng khử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy (DPPH) thành 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazin (DPPH - H). DPPH là một gốc tự do bền nhờ sự di chuyển bất định của cặp electron tự do trong phân tử, có màu tím khơng tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Dưới tác động của chất oxy hóa AH sẽ cho 1 nguyên tử H và DPPH bị khử thành DPPH-H, dung dịch DPPH màu tím sẽ chuyển sang màu vàng của DPPH-H (Hoàng Thị Phương Liên,
30
2018). Giá trị mật độ quang OD càng thấp thì khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (W. Brand-Williams và cộng sự, 1995).