VI KHUẨN: THƯƠNG HÀN, LỴ, TẢ, LAO, GIANG MA
2. LÀM TIÊU BẢN NHUỘM VI KHUẨN 1 Vật liệu và hóa chất cần thiết
2.2.1. Dàn đồ phiến
Chọn lam kính sạch, khơng mốc, khơng xước, khơng ướt. Dùng que cấy lấy canh khuẩn (hoặc bệnh phẩm) đặt lên giữa lam kính sao cho vịng que cấy nằm sát lam kính. Dàn theo đường xoắn ốc từ trong ra ngồi hoặc theo đường rích rắc sát nhau, tạo nên một vùng liên tục chứa canh khuẩn có đường kính khoảng 1 cm. Yêu cầu phải dàn đều mỏng để việc quan sát trên kính hiển vi được dễ dàng.
2.2.2. Để khô
Sau khi dàn đồ phiến, để tiêu bản khơ tự nhiên (tuyệt đối khơng được hơ nóng), vi khuẩn sẽ từ từ gắn vào lam kính mà khơng bị biến dạng. Nếu tiêu bản chưa khô mà ta làm bước tiếp theo (cố định) thì vi khuẩn sẽ bị trơi mất (nếu cố định bằng hóa chất) hoặc bị biến dạng (nếu cố định bằng nhiệt độ).
2.2.3. Cố định
Có thể cố định bằng hóa chất, bằng nhiệt hoặc phối hợp cả hai tùy thuộc vào từng kỹ thuật nhuộm.
Cố định bằng hóa chất: nhỏ dung dịch cố định phủ lên nơi dàn đồ phiến hoặc ngâm cả lam kính vào trong dung dịch cố định với thời gian thích hợp.
Cố định bằng nhiệt: lam kính được đưa qua đưa lại, cắt ngang ngọn đèn cồn 3-4 lần sao cho nhiệt độ lên khoảng 80°C.
Cố định có 3 tác dụng:
- Gắn chặt vi khuẩn vào lam kính - Giết chết vi khuẩn
- Chuẩn bị cho vi khuẩn bắt màu tốt hơn (do vi khuẩn chết khơng cịn khả năng thấm chọn lọc các chất).
2.2.4. Nhuộm
Có 2 phương pháp nhuộm:
2.2.4.1. Phương pháp nhuộm đơn
Nhuộm đơn là phương pháp dùng một loại hóa chất màu để nhuộm vi khuẩn. Hóa chất nhuộm màu gì thì vi khuẩn sẽ bắt màu đấy. Nhuộm đơn chỉ cho ta biết được hình thể, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn mà khơng cho phép phân biệt được tính chất bắt màu khác nhau giữa các vi khuẩn có bản chất khơng giống nhau. Sau khi tiêu bản đã được cố định, nhỏ thuốc nhuộm (xanh methylene hoặc đỏ fuchsin...) phủ kín đồ phiến. Sau 1 phút đổ thuốc nhuộm, rửa phiến kính dưới vịi nước chảy nhẹ, để khơ và soi trên kính hiển vi. 2.2.4.2. Phương pháp nhuộm kép
Nhuộm kép là phương pháp dùng hai loại hóa chất màu trở lên để nhuộm vi khuẩn. Trên vi trường có thể thấy các vi khuẩn khác nhau bắt màu khác nhau, tùy từng tính chất của vi khuẩn.
Trong phương pháp nhuộm kép có nhiều kỹ thuật nhuộm khác nhau như: kỹ thuật Ziehl Neelssen nhuộm vi khuẩn lao, kỹ thuật Neisser nhuộm vi khuẩn bạch hầu, kỹ thuật nhuộm thấm bạc nhuộm vi khuẩn giang mai ... Trong phạm vi của bài, chỉ giới thiệu kỹ thuật nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật cơ bản nhất trong vi khuẩn học. Kỹ thuật này do Christian Gram xây dựng năm 1884. Nhờ kỹ thuật nhuộm Gram, người ta không những biết được hình thể, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn mà cịn biết được tính chất bắt màu khác nhau của các vi khuẩn khơng giống nhau, giúp chúng ta có hướng chẩn đốn tốt, phân biệt được vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
- Kỹ thuật nhuộm Gram
Sau khi dàn đồ phiến, để khô, cố định tiêu bản bằng nhiệt, tiến hành các bước theo thứ tự sau:
+ Nhỏ dung dịch tím gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, duy trì 1- 2 phút + Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản dưới vịi nước chảy nhẹ + Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây
+ Đổ dung dịch lugol, rửa nước
+ Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 90% lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để cho cổn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia. Khi thấy màu tím trên lam kính vừa phai hết thì rửa nước ngay. Thời gian tẩy màu phụ thuộc vào độ dày hay mỏng của vi khuẩn dàn trên lam kính.
+ Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin, để 1 - 2 phút
+ Rửa nước kỹ, để khơ tiêu bản, soi kính hiển vị. - Nhận định kết quả:
Trên vi trường, các vi khuẩn bắt màu tím là Gram dương các vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram âm.
TỰ LƯỢNG GIÁ
1. Vẽ hình thể, tính chất bắt màu và tính kích thước gần đúng của 6 vi khuẩn đã được xem trong buổi thực tập.
2. Nhuộm 1 tiêu bản đơn.
3. Nhuộm 1 tiêu bản Gram, lượng giá theo thang điểm sau: 3.. Nhuộm 1 tiêu bản Gram, lượng giá thang điểm sau
STT Các bước thực hiện chủ yếu hệ số Lượng giá *
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Chuẩn bị lam kính, canh khuẩn và các dụng cụ khác
Dàn đồ phiến Để khơ tự nhiên Cố định bằng nhiệt độ
Nhỏ dung dịch tím Gentian duy trì 1 - 2 phút Rửa nước nhỏ Lu gol duy trì 30 giây
Rửa nước
Tẩy màu bằng cồn 90% Euwar nước
Nhỏ dung dịch Fuchsin duy trì 1 -2 phút Rửa nước kĩ
Để khơ, soi kính
Nhận định kết quả nhuộm phân biệt vi khuẩn bắt màu tím và vi khuẩn bắt màu đỏ
1
Tổng điểm
* 2: Làm tốt; 1: làm được; 0: làm không đạt yêu cầu hoặc không làm
Đọc và nhận định tiêu bản: chỉ được vi khuẩn bắt màu Gram dương và vi khuẩn bắt màu Gram âm.