*Phƣơng pháp lấy vật liệu di truyền
Muốn chẩn đoán bất thƣờng nhiễm sắc thể, đầu tiên phải lấy đƣợc các vật liệu di truyền từ thai nhi. Có thể dùng các phƣơng pháp:
- Chọc hút nƣớc ối (Amniocentesis).
- Sinh thiết nhau thai (Chrionic Villus sampling).
- Lấy máu cuống rốn (Percutaneous umbilical cord blood sampling). a) Chọc hút nước ối (Amniocentesis)
Là thủ thuật chọc kim vào buồng ối để hút nƣớc ối ra làm xét nghiệm. Năm 1968, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc rối loạn nhiễm sắc thể ở hội chứng Down nhờ phƣơng pháp này. Tuy nhiên phƣơng pháp này cho phép chẩn đoán muộn (tuổi thai từ 15 – 18 tuần tuổi trở lên) và gây ra những tai biến nhất định nhƣ chọc hút thất bại; nguy cơ đối với thai: sẩy thai (0,5-1%), rò ối (1%), nhiễm khuẩn ối (0,5 – 1,5/1.000), chảy máu, phản ứng kháng nguyên kháng thể Rh, gây biến dạng xƣơng
khớp, nguy cơ đối với mẹ: chảy máu vào ổ bụng do chọc vào các mạch máu ở đoạn dƣới tử cung hay động mạch thƣợng vị dƣới, đau bụng (8% - Henrion và Para) do huyết tụ [63],[71],[120].
Nƣớc ối là một bệnh phẩm quan trọng cho phép làm một số phân tích để thăm dị tình trạng của thai: các xét nghiệm sinh hóa của nƣớc ối, các xét nghiệm về miễn dịch, các xét nghiệm về vi sinh y học và đặc biệt là xét nghiệm nuôi cấy tế bào nƣớc ối để làm nhiễm sắc thể đồ thai nhi trong những trƣờng hợp thai nhi có bất thƣờng về hình thái trên siêu âm. Chọc hút nƣớc ối là một trong những phƣơng pháp lấy bệnh phẩm của thai nhi, bằng cách đƣa một kim vào buồng ối qua thành bụng dƣới sự hƣớng dẫn của siêu âm hoặc là không, để hút nƣớc ối.
Năm 1966, Edwards đã chẩn đốn đƣợc giới tính của cặp song sinh 1 nam và 1 nữ từ nƣớc ối. Từ khi ứng dụng các phƣơng pháp và các phƣơng tiện vào chẩn đốn trƣớc sinh thì chọc hút nƣớc ối càng trở lên cần thiết. Ngƣời ta đều thừa nhận rằng, về mặt kỹ thuật thì đây là một phƣơng pháp lấy bệnh phẩm thai nhi đơn giản, dễ làm, hiệu quả và ít biến chứng nhất [59].
Từ khi ứng dụng phƣơng pháp siêu âm hình thái thai nhi vào chẩn đốn trƣớc sinh nhằm phát hiện các dị dạng về hình thái của thai nhi thì chọc hút nƣớc ối càng đóng vai trị quan trọng, giúp các nhà chẩn đốn trƣớc sinh tìm hiểu các nguyên nhân cũng nhƣ xác định sự liên quan của các bất thƣờng hình thái thai nhi và các tổn thƣơng nhiễm sắc thể, giúp cho việc quyết định thái độ xử trí đối với thai nghén thơng qua sự phân tích kết quả nhiễm sắc thể đồ thai nhi bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào nƣớc ối [5],[15].
Chọc hút nƣớc ối không gây đau nên không cần phải sử dụng thuốc giảm đau cho sản phụ trƣớc khi chọc. Hiện nay, chọc hút nƣớc ối đƣợc thực hiện dƣới hƣớng dẫn của siêu âm, số lƣợng nƣớc ối đƣợc lấy ra theo tuổi thai 1ml/1 tuần tuổi thai cho thai dƣới 15 tuần, trung bình 20ml. Số lần chọc hút nƣớc ối trung bình là một lần, thời gian chọc hút nƣớc diễn ra nhanh trong vòng 1-2 phút. Nƣớc ối đƣợc đựng vào một ống đặc biệt sau đó gửi đến phịng xét nghiệm ni cấy để làm các xét nghiệm
trên. Hầu nhƣ khơng có tai biến nào xảy ra đối với sản phụ cũng nhƣ thai nhi trong và sau khi làm thủ thuật.
Nghiên cứu của Trần Danh Cƣờng và cộng sự (2009) trên 300 thai phụ thuộc nhóm nguy cơ cao có tuổi thai trên 16 tuần đƣợc chọc hút nƣớc ối tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội. Các chỉ định chính là triples test (+) (25%), siêu âm thai bất thƣờng (17%) và tăng độ mờ da gáy (KSSG) (11%). Thủ thuật đơn giản, tiến hành an tồn, khơng có tai biến. Kết quả cho thấy tỷ lệ bất thƣờng NST là 7,3%, trong đó cao nhất là hội chứng Down (4,3%), hội chứng Edwards (1,3%), hội chứng Turner (0,66%) [9].
b) Sinh thiết nhau thai (Chorionic Villus Sampling)
Kỹ thuật sinh thiết nhau thai đƣợc Brambati và Simoni (1982) thực hiện bằng cách sinh thiết nhau thai qua cổ tử cung dƣới sự hƣớng dẫn của siêu âm tức thời đã xét nghiệm và chẩn đoán đƣợc hội chứng Down ở thai tuần thứ 11. Năm 1997, Hahnemann và cộng sự đã chẩn đoán nhiễm sắc thể qua sinh thiết nhau thai cho 192 thai phụ [74]. Tại Bệnh viện Từ Dũ, sinh thiết nhau thai và cấy dài ngày với những thai kỳ 11-13 tuần ở 29 trƣờng hợp [16]. Phƣơng pháp này có thể tiến hành trong 3 tháng đầu của thai kỳ. Tuy nhiên tỷ lệ sẩy thai là 2 – 3%, chảy máu âm đạo (7 - 10%), ngồi ra cịn gây nhiễm khuẩn và dị tật cho thai nhi. Các tế bào lông nhau đƣợc phân tích bằng các phƣơng pháp khác nhau. Xét nghiệm phổ biến là làm nhiễm sắc thể đồ của thai. Có nghiên cứu cho thấy tăng tần suất và mức độ nghiêm trọng của dị tật ngắn chi ở trẻ em sinh ra sau khi làm thủ thuật đƣợc tiến hành trƣớc 10 tuần hay 70 ngày tuổi thai) [4]. Để có thể áp dụng sinh thiết nhau thai trong chẩn đoán tiền sản cần phải tiến hành thêm nhiều nghiên cứu nữa trên nhiều đối tƣợng để đánh giá về tỷ lệ sẩy thai, khả năng gây dị tật cho thai do thủ thuật sinh thiết gây ra sau đó kiểm tra sự chính xác của kết quả ni cấy nhau thai [90].
c) Lấy máu cuống rốn (Cordocentesis hay Percutaneous umbilical cord blood sampling (PUBS))
Kỹ thuật lấy máu cuống rốn qua da tƣơng tự nhƣ chọc hút nƣớc ối, nhƣng chỉ thay việc lấy dịch ối bao xung quanh thai bằng lấy máu thai nhi. Siêu âm quyết định vị trí của kim đƣa vào bánh nhau và kim sẽ đi xuyên qua thành bụng, thành tử cung để vào trong tĩnh mạch thai trong dây rốn, nơi mà máu của thai nhi đƣợc lấy ra. Kỹ thuật này thực hiện đƣợc rất muộn (khi thai nhi đã trên 18 tuần) và đòi hỏi chuyên mơn cao, khó phổ biến rộng rãi. Phƣơng pháp này cũng gây nguy cơ sẩy thai 1-2% [37].
*Phân tích vật liệu di truyền từ các mẫu xâm lấn: dịch ối, nhau thai, máu cuống rốn
Sau khi lấy đƣợc các vật liệu di truyền của thai nhi nhƣ trên, ngƣời ta tiến hành các phân tích về di truyền để chẩn đoán bằng một trong hai phƣơng pháp sau:
a. Phương pháp di truyền học tế bào (phân tích nhiễm sắc thể) bằng ni cấy
tế bào ối, tế bào nhau thai hay các tế bào bạch cầu lympho để xác định nhiễm sắc thể đồ của thai nhi.
- Về nuôi cấy tế bào ối: Dịch ối là hỗn hợp tế bào đồng nhất, phụ thuộc các giai đoạn phát triển của rau thai, gồm các tế bào màng ối, tế bào da tiết niệu, hơ hấp, tế bào máu mẹ và thậm chí có thể có cả tế bào máu thai nhi nên phân tích tế bào ối đƣợc xem nhƣ phƣơng pháp thuận tiện nhất, đáng tin cậy nhất [3],[7].
- Nuôi cấy tế bào nhau thai: ngƣời ta nuôi cấy các tế bào thai nhi lấy từ nhau thai.
- Nuôi cấy bạch cầu Lympho: là phƣơng pháp thƣờng quy để nghiên cứu nhiễm sắc thể ngƣời.
Q trình ni cấy tế bào, ngƣời ta dùng các thuốc kích thích phân bào PHA cùng Colchicine hoặc Colcemid để tích lũy nhiều tế bào đang phân chia ngừng ở kì giữa- kì mà nhiễm sắc thể trong tế bào co ngắn cực đại, có cấu trúc điển hình nhất, thuận lợi cho nghiên cứu. Muốn xác định từng cặp nhiễm sắc thể trong nhiễm sắc thể đồ sau nuôi cấy phải áp dụng kỹ thuật nhuộm băng (băng G, băng Q, băng R, C, T…) [68],[127].
b. Phương pháp di truyền học phân tử bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH)
FISH là 1 kỹ thuật tế bào phân tử, dùng một trình tự ngắn của chuỗi ADN sợi đơn, gọi là mẫu ADN dò (đƣợc đánh dấu bằng huỳnh quang). Một mẫu ADN dò đƣợc lai với các ADN đích trên nhiễm sắc thể của tế bào gian kì hoặc các nhiễm sắc thể ở kì giữa, kết quả đƣợc đọc trên kính hiển vi huỳnh quang. Một mẫu ADN dị sẽ lai với 2 vị trí trên 2 nhiễm sắc thể của cặp nhiễm sắc thể tƣơng đồng trong nhân tế bào sinh dƣỡng. Nếu mẫu dị lai với 3 vị trí thay vì 2 vị trí nhƣ bình thƣờng trên nhiễm sắc thể 21 chứng tỏ bệnh nhân có biểu hiện hội chứng Down.
Nhờ kỹ thuật này có thể phát hiện những bất thƣờng do đoạn gen nhỏ gây ra với độ phân giải cao. Phƣơng pháp này còn phát hiện đƣợc cả bất thƣờng nhiễm sắc thể ở gian kì mà khơng cần tiến hành nuôi cấy tế bào và nhuộm băng nhiễm sắc thể. Tuy nhiên giá thành của kỹ thuật này cao hơn nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy thông thƣờng. Đồng thời địi hỏi thiết bị, chun mơn cao và mất nhiều thời gian để đọc kết quả nên không thể triển khai rộng rãi trên quy mô lớn [57],[68],[94].
FISH dị tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic trên NST mong muốn bằng cách dùng đầu dò đƣợc đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào). Quy trình thực hiện kỹ thuật FISH bao gồm các bƣớc cơ bản sau:
- Chuẩn bị mẫu và đầu dò - Cố định mẫu.
- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào. - Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dị khơng đƣợc lai.
- Dị tìm mẫu (bƣớc này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp).
Hình1.1: Các bƣớc chính của kỹ thuật FISH
c. Phương pháp nhân gen PCR:
Trong nghiên cứu này có dùng kỹ thuật Nested PCR để chứng minh sự có mặt của ADN phơi thai trong máu ngoại vi của mẹ. Phƣơng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu tƣơng ứng với kỹ thuật realtime PCR. Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng 2 cặp mồi để khuếch đại đoạn gen đích. Cặp mồi ngồi khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc dài hơn, đoạn gen này bao phủ cả đoạn sản phẩm gen của cặp mồi trong. Sản phẩm của cặp mồi ngoài đƣợc dùng là mẫu ADN khuếch đại của cặp mồi trong.
Ƣu điểm của kỹ thuật này là sản phẩm khuếch đại của cặp mồi trong rất đặc hiệu và khơng bắt cặp vào các trình tự khơng mong muốn. Bình thƣờng số chu kỳ khuếch đại của mồi ngồi khơng q lớn để tránh trƣờng hợp sản phẩm của mồi trong bắt phải trình tự gen khơng mong muốn. Số chu kỳ khuếch đại của mồi trong nhiều hơn số chu kỳ khuếch đại của mồi ngoài, nhƣng số chu kỳ khuếch đại của mồi trong khơng vƣợt q 45 chu kỳ.
Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng)
Real-time PCR là một cải biến của phƣơng pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq ADN polymerase do Holland và cộng sự công bố năm
1991. Trong phản ứng Real-time PCR, ngƣời ta thƣờng sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào ADN mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX...)
Tác nhân liên kết với mạch đơi ADN: Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm ADN mạch đơi do q trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với ADN mạch đôi nhƣ SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa đƣợc tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch).
Nguyên tắc của kỹ thuật Realtime – PCR sử dụng Taqman probe: Trong kỹ thuật này, Realtime-PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa 2 thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang đƣợc khi có sự hiển diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ADN đích, đó là (1) Taqman probe, là những
oligonucleotides có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu ADN đích và trình tự này dài khoảng 24-30 nucleotides với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (cịn gọi là Reporter) cịn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (gọi là quencher) để hấp thụ đƣợc ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thủy giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp nên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe đƣợc minh họa bằng hình 1.3.
Hình 1.3. Phƣơng pháp Real-time PCR với mẫu dị TaqMan
Có thể tóm tắt cơ chế này nhƣ sau: (1): khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ ADN đích thì Taqman probe vẫn cịn ngun vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra đƣợc từ reporter ở đầu 5’sẽ bị quencher ở đầu 3’ của
probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát huỳnh quang khi nhân đƣợc nguồn sáng kích thích.
Hình 1.4. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Realtime-PCR
(2) Khi bắt đầu xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát đƣợc huỳnh quang khi
nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩm khuếch đại thì số lƣợng reporter tự do càng nhiều, đến một lúc nào đó cƣờng độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
Cuối cùng xác định số bản copy tác nhân đích có trong mẫu thử hay bệnh phẩm dựa vào hệ số pha loãng mẫu và hệ số tách chiết ADN hay ARN của phƣơng pháp chuẩn bị mẫu trƣớc khi thực hiện PCR.
Cụ thể phƣơng pháp tính tốn số bản copy của ADN đích ban đầu trong ống phản ứng dựa vào đƣờng biểu diễn chuẩn nhƣ sau:
- Đƣờng biểu diễn chuẩn cho đƣợc một hàm số biểu thị mối tƣơng quan giữa chu kỳ ngƣỡng Ct với Log10 của số lƣợng bản ADN đích ban đầu có trong ống phản ứng (X= log10Sq). Hàm số đó là Y = [Slope (X) ] + intercept, và các thông số Slope và intercept đều hiển thị trên biểu đồ chuẩn.
- Từ hàm số này, ngƣời làm thí nghiệm sẽ biết đƣợc tại sao máy tính hiển thị đƣợc Sq, đó là nhờ tính tốn từ Sq = 10[(Ct – intercept)/Slope]
STR (Short Tandem Repeat) là các trình tự lặp lại thƣờng thuộc các đoạn khơng mã hố trên ADN. Đó là các vùng siêu biến của bộ gen với các đơn vị lặp có chiều dài từ 2-7 nucleotid. Các đoạn ADN có trình tự lặp lại này khác nhau về kích thƣớc. Sự đa hình của các STR xuất phát từ sự thay đổi số lƣợng các đơn vị lặp lại, dẫn đến sự đa dạng chiều dài của các alen trong gen đích [20],[23],[31],[38], [62],[64],[68].
Khi tiến hành kỹ thuật PCR, các alen STR có thể đƣợc khuếch đại và phân biệt rõ ràng trên hình ảnh điện di polyacrylamid. Bình thƣờng một cá thể có 2 NST trong mỗi cặp tƣơng đồng nên mỗi locus STR sẽ có tối đa 2 alen, một alen có nguồn gốc từ mẹ và alen cịn lại có nguồn gốc từ bố. Trong trƣờng hợp số alen nhiều hơn 2, chứng tỏ có sự bất thƣờng trên NST đó. Chính vì thế, phƣơng pháp nhân gen PCR các locus STR có thể ứng dụng trong xác định bất thƣờng NST thông qua xác định số lƣợng alen của locus trên NST cần khảo sát.
Trong xác định bất thƣờng NST thể các locus STR cần thoả mãn các yêu cầu sau:
- Thứ nhất: Locus STR phải có tính đa hình và tỉ lệ dị hợp tử cao.
- Thứ hai: Locus STR phải có kích thƣớc ngắn (vì có tính bền vững cao hơn, ít bị đứt gẫy hơn khi có sự tác động của điều kiện tự nhiên và khuếch đại PCR dễ dàng hơn).
Gần đây ngƣời ta đã phát hiện ra các trình tự lặp ngắn STR có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên nhiễm sắc thể số 13, 21, 18, X, Y. Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen PCR những locus này, chúng ta có thể xác định đƣợc số