2 Primer S1, S, Extra Marker XY, 13, 18,
3.1.3. Định lƣợng số bản copy của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
Theo các nghiên cứu trên thế giới, nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở các tuần tuổi khác nhau có hàm lƣợng và nồng độ khác nhau. Việc chẩn đoán và sàng lọc các bệnh di truyền trƣớc khi sinh phụ thuộc rất nhiều
vào hàm lƣợng ADN phôi thai tự do tách đƣợc. Khi tuổi thai thấp thì hàm lƣợng ADN thấp, lƣợng ADN phôi thai tự do tách đƣợc quá nhỏ hoặc không tách đƣợc sẽ dẫn tới việc sàng lọc và chẩn đốn khơng chính xác. Ngƣợc lại khi tuổi thai lớn thì hàm lƣợng ADN cao việc chẩn đốn chính xác hơn nhƣng do tuổi thai muộn khi biết đƣợc các dị tật hay mang gen bệnh, để xâm lấn vào thai nhi khi đó rất khó khăn và ảnh hƣởng tới sức khỏe của ngƣời mẹ. Do vậy, việc khảo sát nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để chọn ra một nồng độ ADN thích hợp nhất và tuổi thai thích hợp nhất cho việc sàng lọc, chẩn đoán và xâm lấn, điều trị của thai nhi.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn thời điểm các tuổi thai từ tuần thứ 6 đến tuần thứ 22 của thai kỳ của 60 mẫu nghiên cứu. Ở mỗi tuần thai mẫu đƣợc lấy 5ml máu ở tất cả các tuần này, các mẫu đƣợc xác định chính xác dƣơng tính với gen SRY và dƣơng tính với gen DYS14 ở tuần thứ 12 đƣợc lựa chọn tiếp theo để lấy mẫu định lƣợng nồng độ ở các tuần thai 13 đến 22 tuần. Các mẫu nghiên cứu này vừa đƣợc nhân gen trên gen SRY vừa đƣợc định lƣợng số bản copy trên gen DYS14 bằng cặp mồi trên nhiễm sắc thể Y (gen DYS14) và gen GAPDH làm nội chứng.
Phản ứng PCR với tổng thể tích phản ứng là 25µl trong đó PCR master mix 10µl; Primer SRY (F, R Probe): (0,25:0,25:0,5)µl và primer GAPDH (F, R, Probe): (0,25: 0,25: 0,5)µl; nƣớc: 8µl, cịn lại là thể tích mẫu nghiên cứu.
Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng của máy relatime-PCR RotoGen–Q đã tích hợp sẵn và các thuật tốn thống kê trên phần mềm phân tích số liệu Microsoft Office Excel.
Dƣới đây là kết quả đƣờng chuẩn của gen DYS14 và đƣờng chuẩn của gen GAPDH ở mẫu chuẩn pha loãng ở các nồng độ 106; 104; 102; 100 copy/ml:
Hình 3.4. Phân tích đƣờng chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH
Từ kết quả hình ảnh trên nhận thấy rằng tín hiệu của gen GAPDH lên đẹp, đƣờng chuẩn tốt có hệ số R=0,99997; R2=0,99993, hệ số tƣơng quan rất chặt. Để tính đƣợc số bản copy của các mẫu nghiên cứu của gen GAPDH theo công thức:
Gen DYS14 với tín hiệu huỳnh quang màu xanh dƣới đây cũng cho tín hiệu tốt và đƣờng chuẩn với hệ số tƣơng quan chặt R=0,99988 và R2=0,99975.
Số bản copy của gen SRY đƣợc tính theo cơng thức sau:
Cơng thức tính số bản copy/1ml máu:
= 𝑄𝑥 𝑉𝑎𝑑𝑛 𝑉𝑝𝑐𝑟
1 𝑉𝑒𝑥𝑡
Trong đó Q là giá trị tính đƣợc theo cơng thức đƣờng chuẩn, Vadn là thể tích mẫu đƣợc đƣa vào phản ứng PCR, Vpcr là tổng thể tích phản ứng PCR, Vext là thể tích huyết tƣơng để tách ADN phơi thai tự do.
Bảng 3.2. Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nam
Tuổi thai 6 tuần 7 tuần 8 tuần 9 tuần 10 tuần 11 tuần 12 tuần
STT Mã Mã bệnh nhân A B A B A B A B A B A B A B 1 269 332 4,78 1291 13,32 2970 1,57 2998 12,51 3754 20,87 3897 7,56 3789 20,07 2 277 13 0,18 15 0,61 24 0,69 30 0,73 45 5,95 59 5,09 70 1,63 3 296 3,51 0,03 12 0,38 50 9,84 37 3,74 36 3,68 46 4,67 27 4,43 4 297 29 0,07 56 0,25 287 2,66 231 1,87 160 0,37 189 1,49 279 2,78 5 298 15 0,47 59 2,22 136 0,15 149 1,15 120 0,64 169 0,89 180 0,86 6 301 112 0,91 321 12,79 1010 10,97 867 2,71 812 16,4 700 1,45 754 0,95 7 303 2 0,01 9 0,08 16,60 1,2 16,6 1,67 16,6 0,2 16,6 0,13 16,60 1,31 8 308 0 0 1 0,01 1,48 0,21 8,6 1,10 9,8 1,52 10,9 4,66 16 1,74 9 314 0 0 2 0,03 5 0,01 13 0,30 26 0,53 40,2 8,68 40,2 2,09 10 316 12 0,10 59 0,49 135 0,84 150 1,16 89 1,09 120 0,91 125 0,73 11 317 298 1,40 1112 5,22 1960 4,53 2120,2 8,21 2145,6 10,89 2003,1 14,62 2008,90 5,69 12 322 2,1 0,01 21,3 0,07 72,4 9,58 75,4 8,47 78,9 6,21 56,8 10,22 59 5,98 13 323 20 0,05 100 0,01 231 8,28 180 6,78 198 9,93 201,2 19,73 221,10 7,44 14 327 78,1 0,10 78,1 0,37 78,1 0,19 78,1 3,24 78,1 0,97 78,1 0,6 78,1 0,63 15 331 23 1,22 54,8 2,91 110,4 5,87 120,8 7,73 201,9 12,71 257 15,21 300,10 8,85 16 537 67,9 0,13 169,8 0,33 231 0,90 249 1,93 278 2,32 301 0,87 344 0,6 17 538 15 0,02 32,4 0,04 72,4 2,27 70,4 2,74 78 2 103 4,12 150 3,42 18 540 128 0,67 200 1,05 401 1,67 470 11,97 527 13,11 550,2 27,51 570,80 8,14 19 542 43,8 0,95 123 1,03 123 2,66 136 2,92 145 2,18 154 1,93 167 0,76 20 545 23,8 0,14 43,3 0,26 67,7 5,60 70,6 3,36 66,7 2,78 80,9 0,84 98 1,88 21 551 189 1,66 100 0,12 686 2,21 532 4,12 418 1,44 455 4,93 598 0,84 22 555 0 0 16 0,06 36 0,07 34 0,14 54 1,26 67,8 1,31 109 14,67 23 567 32 0,24 54,8 1,72 100,6 3,15 134,5 7,51 195 8,82 200,5 9,07 234 10,54 24 570 43,2 3,27 58,9 1,47 128 0,85 136,7 1,39 139 3,80 150 1,13 176,7 3,46 25 575 23 0,19 34 0,28 41,5 0,18 47 0,36 65 0,55 79 0,6 92,6 0,39 26 582 54,2 0,44 110,40 9,12 125 10,33 164 3,16 154,7 3,29 175,3 10,37 192,4 3,11 27 583 0 0 8,8 1,18 16,6 0,69 23,6 0,76 36,9 0,63 54,8 1,16 73,5 2,95 28 621 110 0,5 126 5,70 159 0,76 180 1,24 192 2,48 208 3,41 223 2,17 29 622 125 0,83 238 1,58 350 1,21 367 2,64 380 1,35 398 1,29 412,6 1,8 30 623 68,80 0,3 125 0,55 260 1,22 278,3 1,78 289 2,65 312,8 2,77 345,9 1,58 TB 50,69 0,52 85,77 1,97 135,19 1,68 151,68 1,72 167,29 2,26 182,91 2,83 206,63 3,7 SD 83,56 1,05 295,16 3,60 632,33 3,45 642,98 3,38 755,11 5,36 761,28 6,52 742,55 4,57
Bảng 3.3. Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nữ
STT Mã bệnh
nhân 6 tuần 7 tuần 8 tuần 9 tuần 10 tuần 11 tuần 12 tuần 1 270 4613 463 81300 8791 5080 3620 5100 2 271 27482 2410 1380 1562 692 3620 32100 3 275 12411 1380 27400 22111 18900 4810 15100 4 276 2380 874 52800 25021 4330 1870 1600 5 280 1508 943 1880 2467 3471 1830 1980 6 295 16110 756 52100 41289 1380 4300 3217 7 300 31790 2340 79300 23410 18700 47901 37900 8 309 11867 92100 5190 2410 1990 13800 12380 9 310 1876 16100 4102 5189 4000 19000 7200 10 311 15123 2410 16100 7321 1420 3340 14000 11 315 15192 5190 463 2120 917 1380 1463 12 318 22119 21000 16100 9742 5960 10700 2610 13 319 21126 25700 10800 23652 43300 13600 31300 14 321 765000 16700 28900 12500 17500 15380 16700 15 324 31212 31100 756 657 1350 896 779 16 325 10921 41298 2791 2561 1070 4200 2761 17 326 189500 189000 189000 2410 5620 12800 12410 18 328 34220 24200 4521 2431 6380 2060 1340 19 329 27320 27400 27400 1200 1890 1380 1900 20 330 52430 52800 1610 1243 1980 1100 2510 21 539 1310 13800 15900 14890 31600 53800 55900 22 541 14430 14000 25700 12890 25600 22400 22700 23 543 11180 16100 3190 2579 4380 7000 3840 24 544 11200 43300 43300 4123 4020 6933 4921 25 546 3256 12000 756 879 539 12000 13200 26 547 10791 2791 1210 980 2910 5590 2110 27 549 13410 2410 2410 3210 12800 13200 743 28 550 2120 2340 3512 2229 2210 4640 2160 29 552 11310 1610 15100 9080 4402 1880 5100 30 553 15921 15900 22800 12741 7501 2809 2800
Bảng 3.2 và 3.3 kết quả số liệu nghiên cứu trên 60 phụ nữ mang thai từ tuần thứ 6 đến tuần thứ 12 của thai kỳ và nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở các tuần thai khác nhau, cho thấy nồng độ ADN phôi thai tự do của thai kỳ ở từng ngƣời khác nhau là rất khác nhau và có sự biến thiên tăng dần nồng độ hàm lƣợng của ADN phôi thai tự do theo sự tăng dần của tuổi thai.
Từ bảng này chúng tơi cũng thấy rằng nồng độ trung bình của ADN phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở các tuần từ tuần thứ 6 đến tuần thứ 12 này có độ lệch chuẩn rất lớn và lớn hơn cả giá trị trung bình điều này chứng tỏ nồng độ ADN phôi thai này dao động lớn nhƣ ở tuần 6 của thai kỳ nồng độ trung bình của ADN phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ là 50,69 ± 83,56 bản copy/ml, hay ở tuần thứ 12 là 206,63 ± 742,55 copy/ml.
Theo Lo và cộng sự, (1998) [88] nghiên cứu trên 27 phụ nữ mang thai ở quý đầu của thai kỳ, quý thứ 2 và quý thứ 3 của thai kỳ, các phụ nữ này mang thai bằng kỹ thuật IVF, cho thấy ở quý I của thai kỳ số bản copy của gen SRY trong huyết tƣơng của mẹ vào khoảng 4,0 đến 58,1 bản copy/ml điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi ở tuần thứ 6 của thai kỳ, mặc dù ở các tuần tiếp theo, kết quả của chúng tôi về số bản copy cao hơn so với tác giả này. Cũng theo tác giả Lo và cộng sự (1998) ở giai đoạn muộn quý thứ III của thai kỳ số bản copy của gen SRY trong huyết tƣơng dao động từ 76,9 đến 769 copy/ml.
Nghiên cứu của Costa và cộng sự, (2001) cũng đã dùng kỹ thuật Realtime PCR để chứng minh rằng ADN phôi thai tự do tồn tại trong máu ngoại vi của mẹ [49]. Tác giả Chan và cộng sự, (2004) tách chiết và nghiên cứu nồng độ và phân bố kích thƣớc ADN phơi thai tự do trong máu mẹ trên 156 phụ nữ mang thai từ tuần thứ 7 đến tuần thứ 16 của thai kỳ. Kết quả cho thấy nồng độ ADN phôi thai trong máu mẹ chiếm 3,4- 6,2% so với ADN tự do tổng số [22]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi mẹ dao động từ 0,52% đến 3,7% với tuổi thai từ 6 tuần đến 12 tuần.
Chungwen và cộng sự, (2001) [47] đã định lƣợng ADN tự do của phôi thai trong huyết tƣơng của mẹ của 30 phụ nữ mang thai từ tuần thứ 9 đến tuần thứ 17 của thai kỳ thấy có 19 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY, số bản copy của gen này dao động từ 13,8 đến 291 copy/ml, với nồng độ gen SRY này trong huyết tƣơng là từ 1,28 đến 49,7%, với 2 trƣờng hợp nồng độ rất cao là 29,2% bị hội chứng Down, và một trƣờng hợp nồng độ cao đột biến 47,69% nhƣng bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46,XY. Theo kết quả thể hiện ở bảng số liệu 3.6 và 3.7, chúng tôi chứng minh đƣợc rằng ở các cá thể khác nhau khi mang thai thì nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ biến thiên và mang tính chất đặc trƣng cho từng cá thể. Từ bảng kết quả trên chúng tôi cũng chứng minh đƣợc rằng nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ có xu hƣớng tăng lên khi tuổi thai tăng dần.
Để xác định đƣợc tuổi thai thích hợp nhất, tuổi thai thấp nhất và có nồng độ cao để có thể chẩn đốn chính xác nhất khi ứng dụng vào sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền trƣớc sinh. Chúng tôi tiến hành nhân gen SRY bằng kỹ thuật Nested PCR, siêu âm ở tuổi thai 16 tuần và kiểm tra lại sau sinh và so sánh với kỹ thuật Realtime PCR. Qua bảng số liệu định lƣợng số bản copy của gen DYS14 ở trên của 60 mẫu nghiên cứu ở các tuần từ tuần thứ 6 tới tuần thứ 12 và 2 mẫu nội chứng âm là 2 nữ giới chƣa mang thai và chƣa quan hệ tình dục lần nào và kết quả nhân gen SRY ở các mẫu này và kết quả siêu âm ở tuần thứ 16 và kết quả sau sinh chúng tôi thu đƣợc bảng kết quả so sánh sau:
Bảng 3.4. So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A)
STT Mã Mã bệnh nhân
Tuổi thai (Tuần)
A STT Mã Mã bệnh nhân
Tuổi thai (Tuần)
A 6 7 8 9 10 11 12 6 7 8 9 10 11 12 6 7 8 9 10 11 12 6 7 8 9 10 11 12 1 269 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 31 327 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 2 270 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 32 328 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 3 271 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 33 329 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 4 275 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 34 330 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 5 276 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 35 331 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 6 277 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 36 537 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 7 280 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 37 538 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 8 295 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 38 539 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 9 296 -/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 39 540 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 10 297 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 40 541 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 11 298 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 41 542 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 12 300 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 42 543 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- 13 301 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 43 544 -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-