2 Primer S1, S, Extra Marker XY, 13, 18,
2.2.2.5. Phƣơng pháp phân tích kết quả sản phẩm định lƣợng huỳnh quang sau điện di mao quản
sau điện di mao quản
Phân tích kết quả bình thƣờng
Mầu đỏ có 2 peak tỷ lệ 1:1 (dị hợp tử), mầu đen có 1 peak (đồng hợp tử)
Khuyếch đại các marker STR bằng kỹ thuật QF-PCR tạo ra các sản phẩm huỳnh quang mà nó tỷ lệ trực tiếp với số lƣợng trình tự có trong mẫu ban đầu đƣa vào khuyếch đại. Số lƣợng các sản phẩm PCR huỳnh quang là một giá trị số tƣơng tứng với vùng (area) của peak điện di mao quản. Chiều cao của peak cũng là một thơng số của hoạt động huỳnh quang. Vì vậy nó cũng tỷ lệ trực tiếp với số sản phẩm huỳnh quang. Kết quả của điện di huỳnh quang trên máy ABI phân tích sẽ cho chúng ta hình điện di (electrophoretograms) cũng nhƣ các bảng chỉ ra các thơng tin tƣơng ứng.
Hình 2.6. Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen
Phân tích kết quả tỷ lệ giữa các peak có thể theo chiều cao của peak hoặc diện tích của peak tín hiệu
Trong đó, kích thƣớc (Size) là chiều dài đoạn gen nhân lên tính bằng bp. Vùng và chiều cao là những giá trị tuyệt đối đo hoạt động huỳnh quang và vì vậy là số lƣợng sản phẩm PCR.
Ở ngƣời bình thƣờng có kiểu gen dị hợp tử (heterozygous), tổng số lƣợng huỳnh quang đƣợc tạo ra nhƣ nhau ở cả hai alen. Vì vậy, tỷ lệ giữa vùng và chiều cao của peak huỳnh quang là 1:1 (nhƣ hình).
Ở những ngƣời đồng hợp tử (homozygous), các alen STR có cùng kích thƣớc và đoạn lặp lại, do vậy chiều cao của peak tƣơng ứng với hai alen giống hệt nhau sẽ tăng gấp hai. Cùng một mẫu với số lƣợng bản copy bình thƣờng của một nhiễm sắc
thể sẽ cho dạng dị hợp tử hay đồng hợp tử đối với tất cả các STR. Đánh giá số bản copy bình thƣờng phải dựa trên ít nhất 2 marker có thơng tin về mỗi nhiễm sắc thể.
Phân tích kết quả của Trisomy 21, 18, 13
Trong một mẫu trisomy, có 3 bản copy của mỗi nhiễm sắc thể có thể đƣợc phát hiện với các STR đặc hiệu nhƣ là 3 peak có cùng tín hiệu huỳnh quang và tỷ lệ vùng là 1:1:1 (Trisomic Triallelic).
Nếu hai nhiễm sắc thể có cùng số trình tự lặp, PCR định lƣợng sẽ tạo ra các peak huỳnh quang không cân bằng với tỷ lệ 2:1 (Trisomic Diallelic).
Hình 2.7. Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy
Hình bên trái có 3 peak có tỷ lệ 1:1:1; hình bên phải có 2 peak với tỷ lệ 2:1 Bảng 2.13. Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR
Tỷ lệ peak STR Kết quả
0,8-1,4:1 Bình thƣờng
≤0,6 hoặc ≥1,8:1 Trisomy
Phân tích bằng phần mềm chuyên dụng Genemapper ID 3.2.
- Thiết lập các thông số cho project phân tích: MGX_AneuFast_Bins,
MGX_AneuFast_Panels, AneufastA nalysisMethod, AneufastPlotSettings,
AneufastReportSetting, AneufastSizeStd bằng các lệnh import. - Đặt tên cho project của mỗi cá nhân sử dụng.
- Import các file thu đƣợc từ kết quả điện di mao quản. - Lựa chọn các thông số phù hợp với các thông số điện di. - Phân tích và đọc kết quả thu đƣợc.
- Xác định số alen thông qua số peak, chiều cao peak.