lƣợng NST trƣớc sinh (4 mẫu) Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.2.1.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN trong máu mẹ bằng bộ kít Qiagen
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini Kit (code:51106)
Các bƣớc tiến hành tách chiết ADN đƣợc tiến hành theo các bƣớc nhƣ trong hƣớng dẫn sử dụng của nhà sản xuất bộ kít.
Nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ theo nguyên tắc sẽ phân bố đều trong máu ngoại vi. Trong máu ngoại vi có các thành phần khác nhƣ tế bào hồng cầu, tế bào bạch cầu, tế bào tiểu cầu, các tế bào này có trọng lƣợng lớn hơn ADN phôi thai tự do, do vậy khi ly tâm ở một tốc độ nhất định các thành phần này sẽ lắng xuống đáy và tách thành 2 lớp. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành ly tâm 5 ml máu ngoại vi trong 5.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút để tách thành phần các tế bào máu ngoại vi ra riêng và ADN tự do riêng trong dung dịch huyết tƣơng. Phần huyết tƣơng sau khi ly tâm sẽ đƣợc tách riêng và lƣu trong tủ - 20oC.
Mẫu huyết tƣơng này sẽ đƣợc tách ADN phôi thai tự do bằng nhiều phƣơng pháp. Phƣơng pháp ban đầu chúng tơi tách là dùng 200µl dung dịch huyết tƣơng sau đó biến tính ở nhiệt độ 99oC trong 5 phút, dung dịch sau biến tính sẽ đƣợc ly tâm tốc độ cao 13.000 vòng/phút trong 2 phút và thu dung dịch trong phía trên vào ống 1,5ml mới khác. Phƣơng pháp thứ 2 chúng tơi tách là sử dụng bộ kít của Qiagen (bộ QIAamp ADN blood Mini Kit), code của bộ kít: 51106 có cải tiến với các bƣớc đƣợc nêu chi tiết trong hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Thành phần Số lƣợng/thể tích Thành phần Số lƣợng/thể tích
Cột QIAamp Mini spin
250 chiếc Đệm AW2 65 ml
Ống thu mẫu (2 ml) 750 chiếc Đệm AE 75 ml
Đệm AL 60 ml Qiagen protease 1 ống
Một số bƣớc có cải tiến khi sử dụng bộ kít này để tách ADN phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Bình thƣờng bộ Kít này dùng trực tiếp 200µl máu mẹ để tách ADN từ tế bào máu mẹ. Đối với nghiên cứu này, để tách ADN tự do trong máu ngoại vi, không phải trong các tế bào của máu mẹ, do vậy bƣớc đầu tiên chúng tôi ly tâm mẫu máu sau khi lấy 5ml máu ngoại vi của mẹ vào ống chống đơng EDTA, lấy 400µl mẫu huyết tƣơng ở phía trên để tách ADN tự do thay vì chỉ sử dụng 200µl mẫu nhƣ trong hƣớng dẫn sử dụng của bộ kít. Tiếp theo đó sử dụng 40µl ProteinaseK, 400µl AL buffer rồi lắc đều ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau khi ủ xong cho thêm 400µl Ethanol tuyệt đối vào và lắc đều và tiếp tục tiến hành các bƣớc tiếp theo nhƣ trong hƣớng dẫn sử dụng của bộ kít này. Đến bƣớc cuối cùng ADN đƣợc hịa tan trong 100µl H2O đã ủ ở 70oC trƣớc đó cho vào cột lọc để 5 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành ly tâm để thu đƣợc ADN phôi thai tự do.