1 giờ sau sinh 2 giờ sau sinh 3 giờ sau sinh
3.2.1. Phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
Để phân lập đƣợc tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ chúng tôi lựa chọn là kháng thể kháng CD71. Nguyên tắc cơ bản phân lập tế bào phôi thai dựa vào phức hợp kháng nguyên kháng thể với kháng thể. Để phân lập tốt giữa tế bào phôi thai và tế bào máu ngoại vi của mẹ chúng tơi cịn dựa vào ngun tắc của hạt từ tính. Các hạt từ tính này đƣợc bọc bề mặt ngồi là Streptavidin, kháng thể đƣợc gắn Biotin. Mối liên kết giữa Streptavidin với Biotin là một liên kết rất bền chặt về mặt hóa học. Nguyên tắc của phƣơng pháp này nhƣ sau: Kháng thể đã đƣợc Biotin hóa sẽ đƣợc gắn với hạt từ nhờ mối liên kết streptavidin-Biotin. Dƣới tác dụng của lực từ trƣờng, phức hợp hồng cầu nhân-hạt từ đƣợc hút về 1 cực của nam châm, những kháng thể không
gắn với hạt từ tính sau nhiều lần rửa bằng PBS 1X sẽ đƣợc loại bỏ còn lại phức hợp kháng thể-hạt từ. Phức hợp này sẽ đƣợc đƣa vào ống máu ngoại vi của mẹ và trộn đều hỗn hợp này trong điều kiện 4oC trong 15 phút. Sau đó đặt tồn bộ hỗn hợp này lên giá từ và loại bỏ các thành phần không gắn với giá từ và rửa nhiều lần bằng PBS 1X để loại hết các thành phần không gắn với kháng thể - hạt từ -giá từ tính.
Sau khi thu đƣợc hồng cầu có nhân bằng phƣơng pháp này, chúng tơi nhuộm hồng cầu có nhân bằng thuốc nhuộm huỳnh quang để chứng minh sự tồn tại của tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Bộ thuốc nhuộm mà chúng tơi sử dụng là bộ kít Vysis MultiVysion PGT Multicolor probes trong đó có probe gắn đặc hiệu trên nhiễm sắc thể Y. Bộ kít này cho phép chẩn đốn cùng một lúc bất thƣờng số lƣợng của 5 nhiễm sắc thể đó là nhiễm sắc thể X, Y, 13, 18 và 21. Mỗi nhiễm sắc thể sau khi nhuộm huỳnh quang sẽ cho một màu khác nhau: Nhiễm sắc thể X: phổ màu xanh rêu; Nhiễm sắc thể Y: phổ màu vàng; Nhiễm sắc thể số 13: phổ màu đỏ; Nhiễm sắc thể số 18 : phổ Aqua xanh nƣớc biển; Nhiễm sắc thể số 21: phổ xanh lá cây. Các bƣớc thực hiện đƣợc nêu chi tiết trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Sau khi thực hiện chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau:
Hình 3.21. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 837
Nhận xét: Từ hình ảnh kết quả của hai mẫu nghiên cứu trên thấy rằng mẫu nghiên cứu số 831 xuất hiện 2 nhiễm sắc thể số 18 (chúng tơi đã đánh dấu trên hình 2x), 2 nhiễm sắc thể số 21 (đƣợc đánh dấu 2x), 2 nhiễm sắc thể số 13 với tín hiệu màu đỏ và nhiễm sắc thể giới tính thì xuất hiện 01 nhiễm sắc thể X và 01 nhiễm sắc thể Y. Điều này chứng tỏ đây là một thai nam có bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46,XY. Cũng tƣơng tự nhƣ vậy hình số 3.21 của mẫu nghiên cứu số 837 cũng là một mẫu nghiên cứu có bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46,XY (xuất hiện 2 tín hiệu của NST số 13, 2 tín hiệu của NST số 18, 2 tín hiệu của NST số 21 và một tín hiệu của nhiễm sắc thể X, cùng một tín hiệu của NST Y.
Từ hình ảnh kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào phôi chúng tơi tách đƣợc có xuất hiện NST Y, điều này chứng minh rằng quy trình tách tế bào phơi thai trong máu ngoại vi của mẹ đạt kết quả tốt. Theo tác giả Babochkina, Mergenthaler, Dinges và cộng sự, (2005) đã nghiên cứu nhuộm huỳnh quang tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ trên 19 trƣờng hợp mang thai từ tuần thứ 12 đến 37 tuần. Tác giả đã chứng minh rằng có tế bào phơi thai của con lƣu hành tự do trong máu
ngoại vi mẹ [25]. Theo tác giả Bianchi và cộng sự, (1996) đã chứng minh rằng tế bào bạch cầu lymphoid phơi thai cịn có thể tồn tại 27 năm sau khi đứa trẻ đƣợc sinh ra [32].
Theo tác giả Bianchi và cộng sự (1990) đã tách thành cơng tế bào hồng cầu có nhân của tế bào phôi thai lƣu hành tự do trong máu của mẹ và tác giả đã nhuộm tế bào này bằng thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu cho NST Y, ông cũng chứng minh bằng kết quả nhân gen SRY [28]. Đến năm 1992, Bianchi và cộng sự đã thành công phát hiện tế bào mang bộ nhiễm sắc thể 47,XY,+21 [29].
Bischoff năm 1998 đã nhuộm thành công tế bào hồng cầu có nhân của phôi thai lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ với 5 màu cho 5 nhiễm sắc thể 13, 18, 21 và X, Y [33].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách đƣợc tế bào phôi tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ và chứng minh đƣợc đó là tế bào phôi thai bằng phƣơng pháp nhuộm tế bào bằng bộ kít PGT của Vysis có marker đặc hiệu trên NST Y trên tế bào phôi thai nam. Kết quả này sẽ là bƣớc đầu có thể ứng dụng chẩn đốn các bất thƣờng số lƣợng NST qua tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ góp phần cho các kỹ thuật chẩn đốn di truyền trƣớc sinh bằng biện pháp không xâm lấn.