Đối chiếu nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi- 123docz.net

1 giờ sau sinh 2 giờ sau sinh 3 giờ sau sinh

3.1.7. Đối chiếu nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ với kết quả QF-PCR

QF-PCR

Các bệnh nhân có nguy cơ cao sinh con bị dị tật sau khi sàng lọc bằng xét nghiệm Triple test với nguy cơ lớn hơn 1/250 sẽ đƣợc chọc ối để chẩn đoán các bất thƣờng nhiễm sắc thể số 13, 18, 21 và XY đồng thời cũng đƣợc lấy 5ml máu ngoại vi của mẹ để định lƣợng nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Trong 34 mẫu nguy cơ cao sinh trẻ bị dị tật này chúng tơi chẩn đốn trƣớc sinh bằng kỹ thuật QF-PCR đã đƣợc miêu tả chi tiết ở trên chúng tôi thu đƣợc kết quả 29 mẫu chẩn đốn bình thƣờng (Thai nhi không mắc các hội chứng 13, 18, 21 và XY, chƣa loại trừ các nhiễm sắc thể khác) và có 5 mẫu mang thai bị dị tật: 4 mẫu Trisomy 21, 01 mẫu hội chứng 47,XXY. Ngoài 34 mẫu nghiên cứu đƣợc lấy tại trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dƣợc – HVQY, chúng tôi thu thập đƣợc 5 mẫu nghiên cứu bị bất thƣờng nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Từ Dũ 01 mẫu hội chứng 45,X, 01 mẫu Trisomy 18, 01 mẫu 47,XXY, và 2 mẫu hội chứng 47,XY,+21.

Dƣới đây là hình ảnh các mẫu chẩn đoán bất thƣờng nhiễm sắc thể bằng bộ Kít Aneufast Kit đƣợc điện di mao quản:

Hình 3.14. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR mẫu QF64 (tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thƣờng

Hàng đầu là các locus lần lượt là AMXY, D21S1442, X22, HPRT, D21S1414, SRY. Hàng thứ 2 là các locus : D18S391, D13S631, D21S1411, D18S390, D13S634. Hàng thứ 3 là các locus D18S535, D18S976, D13S258, D18S386, D13S797. Hàng thứ 4 là các locus : D21S1435, D21S1446, DXYS218, DXYS267, D13S305.

Hình 3.14 cho thấy các locus trên nhiễm sắc thể số 13, 18, 21 và XY đều cho các peak với tỷ lệ 1:1. Để chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể số 13 có các locus D13S631; D13S634; D13S258; D13S797; D13S305, trong hình ảnh kết quả của mẫu nghiên cứu QF64 này tất cả các locus trên nhiễm sắc thể số 13 này đều xuất hiện các peak với tỷ lệ là 1:1 dị hợp tử, và xuất hiện 1 peak đồng hợp tử D13S305, D13S797. Các locus trên nhiễm sắc thể số 21: D21S1442; D21S1414; D21S1411; D21S1435; D21S1446 các locus này đều xuất hiện peak với tỷ lệ các peak 1:1 dị hợp tử. Các locus trên nhiễm sắc thể số 18: D18S391; D18S35; D18S976; D18S386 xuất hiện peak dị hợp tử với tỷ lệ 1:1, các locus khác trên nhiễm sắc thể số 18: D18S390 xuất hiện một peak đồng hợp tử. Đối với nhiễm sắc thể giới tính có các locus Amel; X22; DXYS28; DXYS267 nằm trên cả nhiễm sắc thể X và nhiễm sắc thể Y xuất hiện 2 peak với tỷ lệ 1:1. Riêng locus SRY chỉ nằm trên NST Y ở mẫu nghiên cứu này xuất hiện 1 peak chứng tỏ mẫu này là thai nam bình thƣờng.

Chúng tơi đối chiếu so sánh mẫu nghiên cứu này khi định lƣợng nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ thấy rằng nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ của mẫu này là 9,69%. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng các mẫu đƣợc chẩn đốn có bộ NST bình thƣờng 46,XY đối chiếu so sánh với nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ thấy nồng độ ADN phôi thai của các mẫu có bộ nhiễm sắc thể 46,XY trung bình khoảng 10,01 ± 2,67%.

Hình 3.15. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61 (tƣơng ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down

Từ hình ảnh trên cho chúng ta thấy các locus trên NST số 13: locus D13S631; D13S634; D13S258; D13S797; D13S305 xuất hiện các peak với tỷ lệ 1:1 dị hợp tử và

một peak đồng hợp tử. Các locus trên NST số 18: D18S391; D18S35; D18S976; D18S386, D18S390 xuất hiện peak dị hợp tử với tỷ lệ 1:1 và một peak đồng hợp tử, các locus trên NST giới tính XY: Amel; X22; DXYS28; DXYS267 đều xuất hiện 2 peak với tỷ lệ 1:1 và locus khác locus SRY xuất hiện peak của gen SRY chứng tỏ mẫu nghiên cứu mang thai nam. Ở mẫu này các locus trên NST số 21: D21S1442, D21S1411 xuất hiện peak với tỷ lệ 1:1:1. Locus D21S1435, D21S1446 xuất hiện các peak với tỷ lệ 2:1. Từ kết quả này chúng tôi kết luận rằng mẫu nghiên cứu này bị là thai nam bị hội chứng Down (Trisomy 21). Để kiểm chứng lại mẫu này chúng tôi nhân gen lại với primer extra của NST số 21 với 5 locus D21S1809, D21S1412, D21S437, D21S1411, D21S435 và cho kết quả nhƣ hình dƣới đây:

Hình 3.16. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra Marker 21

Hàng 1 là các locus: D21S1809, D21S1412; Hàng thứ 2 là các locus: D21S1437, D21S1411; Hàng thứ 3 là locus D21S1435

Từ hình trên cho chúng ta thấy tất cả 5 locus của NST số 21 này đều xuất hiện các peak với tỷ lệ 2:1; 1:1:1. Locus D21S1412 và locus D21S1411 xuất hiện các peak với tỷ lệ 1:1:1. Locus D21S1809, D21S1437, D21S1435 xuất hiện các peak với tỷ lệ 2:1. Kết quả này khẳng định rằng mẫu DT02 bị hội chứng Down (Trisomy 21), với 3

nhiễm sắc thể số 21. Và chúng tôi cũng nhận thấy rằng sau khi định lƣợng nồng độ ADN tự do của mẫu DT02 này thấy nồng độ ADN tự do trong huyết tƣơng rất cao vào khoảng 85%. Tƣơng tự nhƣ vậy ở các mẫu bị hội chứng Down (Trisomy 21) đều xuất hiện ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng của mẹ với nồng độ cao từ 31% đến 85%.

Dƣới đây là kết quả của trƣờng hợp bị bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể giới tính, mang bộ nhiễm sắc thể 47,XXY.

Hình 3.17. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56 (tƣơng ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter

Từ hình ảnh kết quả trên cho chúng tôi thấy rằng các nhiễm sắc thể thƣờng 13, 18 và 21 ở tất cả các locus của các nhiễm sắc thể này đều xuất hiện các peak với tỷ lệ 1:1 dị hợp tử và một peak đồng hợp tử, điều đó cho thấy mẫu nghiên cứu này có các nhiễm sắc thể thƣờng bình thƣờng. Trên nhiễm sắc thể giới tính X, Y xuất hiện các locus Amel; DXYS28 với các peak tỷ lệ 2:1 điều này chứng tỏ số lƣợng nhiễm sắc thể X gấp đôi số lƣợng nhiễm sắc thể Y; locus X22 xuất hiện 3 peak với tỷ lệ 1:1:1 điều này chứng tỏ mẫu nghiên cứu này có 3 nhiễm sắc thể giới tính. Trong mẫu nghiên cứu này còn xuất hiện peak trên locus SRY điều này chứng tỏ mẫu nghiên cứu có gen SRY của nam giới. Locus DXYS267 chỉ xuất hiện 1 peak đồng hợp tử. Từ kết quả này chúng tôi nhận thấy rằng mẫu nghiên cứu này bị hội chứng Klinefelter (47,XXY).

Và kết quả này đƣợc kiểm tra lại trên bộ primer extra cho nhiễm sắc thể giới tính của bộ kít Aneufast, kết quả nhân gen với các locus chỉ trên NST X và Y cho hình ảnh dƣới đây:

Hình 3.18. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03 (QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y.

Hàng đầu là các locus : AMXY, HPRT, SRY; Hàng 2 là các locus: DXS6803, SBMA, DXS6809; Hàng 3 là các locus DXYS156, DXS8377; hàng 4 là locus TAF9L.

Từ hình trên cho chúng ta thấy các locus chỉ trên NST giới tính X: locus HPRT, SBMA, DXS8377, TAF9L xuất hiện 2 peak của nhiễm sắc thể X với tỷ lệ 1:1 chứng tỏ có 2 nhiễm sắc thể X, các locus Amel, DXS6803, DXYS156 thì xuất hiện các peak với tỷ lệ 2:1, locus gen SRY xuất hiện peak chứng tỏ có nhiễm sắc thể Y. Từ các kết quả này chúng tôi nhận định rằng mẫu nghiên cứu này bị bất thƣờng nhiễm sắc thể giới tính với bộ nhiễm sắc thể 47,XXY.

Khi so sánh mẫu bị hội chứng 47,XXY này với nồng độ ADN phôi thai tự do chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ADN phôi thai tự do cao vào khoảng 30,23%, nhƣng thấp hơn so với nồng độ ADN phôi thai tự do của các trƣờng hợp hội chứng Trisomy 18 và 21. Đối với mẫu bị hội chứng trisomy 18 chúng tơi có kết quả điện di mao quản khi chẩn đốn mẫu này bằng bộ kít Aneufast kít trên 5 nhiễm sắc thể nhƣ sau:

Hình 3.19. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08 mang hội chứng Edwards

Hàng đầu là các locus lần lượt là AMXY, X22, HPRT, D21S1414, SRY. Hàng thứ 2 là các locus : D18S391, D13S631, D21S1411, D18S390, D13S634. Hàng thứ 3 là các locus D18S535, D13S258, D18S386. Hàng thứ 4 là các locus : D21S1435, D21S1446, DXYS218, D13S305.

Từ hình ảnh trên cho thấy các locus trên nhiễm sắc thể số 13: D13S631; D13S634; D13S258; D13S797; D13S305 xuất hiện các peak với tỷ lệ 1:1 đồng hợp tử và một peak đồng hợp tử. Các locus trên nhiễm sắc thể số 21: D21S1412, D21S1411, D21S1809, D21S1437, D21S1435 đều xuất hiện các peak với tỷ lệ 1:1 dị hợp tử hoặc một peak đồng hợp tử và các locus trên nhiễm sắc thể giới tính XY: Amel. DXYD218 xuất hiện 2 peak điều này chứng tỏ mẫu nghiên cứu này có 2 nhiễm sắc thể giới tính, locus SRY xuất hiện peak của locus này chứng tỏ đây là một mẫu mang nhiễm sắc thể giới tính Y. Các locus trên nhiễm sắc thể số 18: D18S391, D18S390 xuất hiện 2 peak với tỷ lệ 2:1 và locus D18S535 xuất hiện ba peak với tỷ lệ 1:1:1. Từ kết quả này chúng tôi nhận định rằng mẫu nghiên cứu này bị hội chứng Edwards.

Chúng tôi đối chiếu nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở mẫu này sau khi định lƣợng nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi thấy rằng nồng độ ADN phơi thai tự do cao hơn so với mức bình thƣờng vào khoảng 31,92%.

Bussani và cộng sự, (2007) đã áp dụng quy trình QF-PCR trong chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng NST 13, 18, 21 và X, Y từ các mẫu dịch âm đạo [38]. Fodor và cộng sự, (2007) đã thành công trong ứng dụng kỹ thuật QF-PCR này để chẩn đoán bất thƣờng NST cho 200 ngƣời đàn ơng khơng có tinh trùng và ít tinh trùng [64]. Ở nghiên cứu của chúng tôi áp dụng trên các mẫu ối và cũng đã thành công trong chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng NST trƣớc sinh ở các mẫu ối này. Tác giả Gole và cộng sự, (2008) còn so sánh kỹ thuật FISH và kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trƣờng hợp lệch bội nhiễm sắc thể số 21, kết quả cho thấy kỹ thuật QF-PCR khơng chẩn đốn đƣợc trƣờng hợp này mà chỉ có kỹ thuật FISH tìm ra đƣợc trƣờng hợp lệch bội nhiễm sắc thể của NST số 21 [68]. Kochhan và cộng sự, (2000) đã áp dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán cho 662 trƣờng hợp trƣớc sinh trên mẫu ối [89].

Dƣới đây là kết quả định lƣợng nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng ngƣời mẹ:

Bảng 3.11. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ mang thai nam bình thường STT Mã BN Tuổi thai Tỷ lệ gen DYS14/ GAPDH (%) QF- PCR STT Mã BN Tuổi thai Tỷ lệ gen DYS14/ GAPDH (%) QF- PCR 1 BT01 16 12,04 46,XY 17 BT17 19 11,78 46XY 2 BT02 16 8,96 46XY 18 BT18 21 14,54 46,XY 3 BT03 16 11,70 46,XY 19 BT19 16 8,23 46,XY 4 BT04 16 11,90 46,XY 20 BT20 17+2 10,30 46,XY 5 BT05 19 9,69 46,XY 21 BT21 22 6,03 46XY 6 BT06 22 11,2 46,XY 22 BT22 21 12,69 46,XY 7 BT07 18 7,42 46,XY 23 BT23 17 5,81 46,XY 8 BT08 18 12,25 46,XY 24 BT24 17 8,30 46,XY 9 BT09 15 11,07 46XY 25 BT25 20 7,84 46XY 10 BT10 26+4 9,75 46,XY 26 BT26 17 9,85 46,XY 11 BT11 18+4 16,64 46,XY 27 BT27 19 8,72 46,XY 12 BT12 18 7,47 46,XY 28 BT28 21 7,32 46,XY 13 BT13 17 12,19 46XY 29 BT29 17+5 13,42 46XY 14 BT14 17 6,98 46,XY TB 18,36 10,01 15 BT15 18 9,90 46,XY SD 2,46 2,67 16 BT16 17 6,29 46,XY

Nhận xét: Với 29 mẫu nghiên cứu với tuổi thai từ 16 đến 22 tuần, trung bình là 18,36 tuần và tuổi mẹ trung bình là 33,55 tuổi chúng tôi tiến hành định lƣợng ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi ở các mẫu nghiên cứu này và tiến hành chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể 13, 18, 21 và nhiễm sắc thể giới tính X, Y thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.11. Kết quả nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở các trƣờng hợp mang thai có bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng này trung bình là 10,01±2,67%.

Bảng 3.12. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ mang thai bất thường

STT Mã bệnh nhân Tuổi

thai Hội chứng Tỷ lệ gen DYS14/

GAPDH (%) QF-PCR 1 DT01 20 47,XY,+21 40,08 47,XY,+21 1 DT01 20 47,XY,+21 40,08 47,XY,+21 2 DT02 16 47,XY,+21 85,32 47,XY,+21 3 DT03 19 47,XXY 30,23 47,XXY 4 DT04 23 47,XY,+21 47,33 47,XY,+21 5 DT05 17 47,XY,+21 50,97 47,XY,+21 6 DT06 16 47,XY,+21 33,03 47,XY,+21 7 DT07 18 47,XY,+21 64,87 47,XY,+21 8 DT08 19 47,XY,+18 31,9 47,XY,+18 9 DT09 19 47,XXY 29,9 47,XXY 10 DT10 20 45,X 0,0 45,X TB 18,56 46,0 SD 2,19 18,8

Nhận xét: Ở bảng 3.12 là kết quả chúng tôi định lƣợng ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ và đồng thời chúng tơi cũng chẩn đốn bất thƣờng nhiễm sắc thể của thai nhi qua mẫu ối và chúng tôi thu đƣợc kết quả trên bảng 3.16. Kết quả này chúng tơi nhận thấy có 6 trƣờng hợp mang hội chứng Down với bộ nhiễm sắc thể 47,XY,+21. Có một trƣờng hợp mang ba nhiễm sắc thể số 18, có 2 trƣờng hợp Klinefelter và một trƣờng hợp Turner. Ở tất cả các mẫu bị dị tật này chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ khá cao trung bình là 46±18,8%.

Chúng tơi so sánh nồng độ ADN phôi thai trong huyết tƣơng của phụ nữ mang thai bị dị tật và những phụ nữ mang thai bình thƣờng ở hai bảng trên chúng tơi nhận thấy rằng các mẫu mang bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng có nồng độ ADN phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ thấp hơn rất nhiều so với các mẫu máu của mẹ mang thai bị các dị tật nhiễm sắc thể. Nồng độ ADN phôi thai trong huyết tƣơng của mẹ ở trƣờng

hợp bình thƣờng là 10,01 ± 2,67% và trƣờng hợp bất thƣờng là 46,0 ± 18,8%, điều này cho thấy nồng độ ADN phôi thai tự do của những trƣờng hợp bị dị tật cao hơn trƣờng hợp bình thƣờng 4,5 lần, sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p=0,00043 (< 0,05), mặc dù tuổi thai và tuổi mẹ trung bình của hai nhóm này khơng khác nhau nhiều, sự khác nhau về tuổi mẹ của 2 nhóm này khơng có ý nghĩa thống kê với p=0,48 (> 0,05).

Chungwen và cộng sự, (2001) nghiên cứu sàng lọc ADN phôi thai tự do trong máu mẹ qua gen xác định giới tính nam giới SRY và gen - actin. Trong số 30 đối

tƣợng thai phụ, 19 trƣờng hợp thai nam đã đƣợc xác định chính xác qua phân tích ADN phơi thai trong máu mẹ với độ chính xác 100% khi đối chiếu với kết quả phân tích bộ nhiễm sắc thể qua tế bào dịch ối. Nồng độ ADN tách chiết đƣợc tăng cao trong trƣờng hợp thai nhi bị Down, nồng độ ADN phôi thai trƣờng hợp bất thƣờng tăng cao hơn trƣờng hợp bình thƣờng khoảng 2,9 lần [46]. Kết quả của chúng tôi cũng khá phù hợp với kết quả của tác giả Chungwen và cộng sự, (2001). Cũng với nghiên cứu nồng độ AND phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ Sparks và cộng sự (2012) đã sàng lọc các trƣờng hợp mang thai bị hội chứng trisomy 13, 18 và 21 lần lƣợt là trisomy 13 nồng độ AND phôi thai tăng 5,2 lần, trisomy 18 là 4,9 lần, trisomy 21 là 5,2-5,4 lần [118].

Đối chiếu nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ với kết quả QF-PCR

Sàng lọc test bộ hai (Double test)

Sàng lọc bộ ba (Triple test)