2 Primer S1, S, Extra Marker XY, 13, 18,
3.1.2. PCR nhân gen SRY
Gen SRY là một gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính Y, gen đặc trƣng cho các trƣờng hợp mang thai nam. Do vậy, trong nghiên cứu này chúng tơi lựa chọn gen này để kiểm tra sự có mặt của ADN phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Và để kiểm chứng việc tách ADN chúng tôi sử dụng thêm 1 gen house keeping
gene (GAPDH) là một gen nội kiểm chứng, khi xuất hiện gen này điều đó chứng tỏ việc tách ADN thành công.
Các mẫu ADN sau khi tách xong ở trên sẽ đƣợc nhân gen bằng kỹ thuật Nested PCR (PCR lồng) cho gen SRY và nhân gen PCR thƣờng cho gen GAPDH. Có rất nhiều tác giả trên thế giới đã đề cập về sự tồn tại của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ, chứng minh sự tồn tại của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ và dùng ADN phôi thai tự do này để sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền.
Lo và cộng sự, 1998 sử dụng gen SRY và gen GAPDH để phát hiện và định lƣợng ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ [88]. Tác giả Bombard và cộng sự, 2011 cũng đã sử dụng gen SRY để xác định sự tồn tại của ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ [34].
Tác giả Akolerka và cộng sự, 2011 sau khi tách chiết đƣợc ADN phôi thai tự do tác giả chẩn đốn bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và con và xác định giới tính thai nhi bằng gen SRY [21]. Nhƣ vậy, gen SRY đƣợc nhiều tác giả lựa chọn nhƣ một marker phân tử để kiểm tra sự có mặt của ADN phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ.
Hình 3.1. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu
M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Âm: Chứng âm nước cất; Dương: Chứng dương nam giới; Mẫu nghiên cứu 825. Bên trái là các mẫu nhân gen
SRY kích thước sản phẩm 198bp. Bên phải là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm 97bp.
Các mẫu chứng âm của cả gen SRY và gen nội chứng GAPDH đều không thấy xuất hiện băng vạch của các sản phẩm, điều này chứng tỏ các mẫu chúng tôi nghiên cứu khơng bị nhiễm trong q trình PCR. Mẫu chứng dƣơng và mẫu nghiên cứu số 825 đều xuất hiện băng ở cả sản phẩm gen SRY và gen GAPDH.
Từ hình 3.1 cho thấy các băng điện di xuất hiện khá rõ nét và gọn, kích thƣớc sản phẩm PCR phù hợp với tính tốn lý thuyết. Trong hình ảnh kết quả điện di các mẫu nghiên cứu của gen SRY có một số mẫu không xuất hiện băng vạch của 198bp và các mẫu xuất hiện băng vạch 198bp. Các mẫu này đƣợc nhân gen GAPDH ở hình trên cho chúng ta thấy tất cả các mẫu nghiên cứu này đều xuất hiện băng vạch của gen GAPDH 97bp điều đó chứng tỏ các mẫu nghiên cứu này đều tách chiết đƣợc ADN. Từ kết quả này chúng tôi chứng minh đƣợc rằng trong máu mẹ ngƣời mang thai có ADN phơi thai tự do của con lƣu hành trong đó.
Hình 3.2. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu từ 811 - 825
M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ 811 đến 825 là các mẫu nghiên cứu. Phía trên là các mẫu nhân gen SRY kích thước sản phẩm 198bp. Phía dưới là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm PCR là 97bp.
Nhận xét: Trong 15 mẫu từ mẫu số 811 đến mẫu số 825 chúng tôi thấy đều xuất hiện băng của gen GAPDH (nửa điện di phía dƣới) điều này cho thấy các mẫu này đều tách đƣợc ADN. Có 5 mẫu: mẫu số 814, 818, 820, 822, 823 không xuất hiện băng sản phẩm của gen SRY chứng tỏ đây là các mẫu mang thai nữ, 10 mẫu còn lại xuất hiện băng sản phẩm của gen SRY là các mẫu mang thai nam. Nhƣ vậy, trong bản điện di trên có 5/15 mẫu âm tính và 10/15 mẫu dƣơng tính với gen SRY.
Hình 3.3. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu từ 826 - 840
M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ 826 đến 840 là các mẫu nghiên cứu. Phía trên là các mẫu nhân gen SRY kích thước sản phẩm 198bp. Phía dưới là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm PCR là 97bp.
Có 15 mẫu từ 826 đến 840 xuất hiện băng sản phẩm của gen GAPDH chứng tỏ các mẫu này đều tách đƣợc ADN. Có 5 mẫu 826, 831, 837, 838, 840 xuất hiện băng vạch sản phẩm của gen SRY chứng tỏ các mẫu này mang thai nam. Các mẫu còn lại 10 mẫu không xuất hiện băng vạch sản phẩm của gen SRY chứng tỏ các mẫu này mang thai nữ. Nhƣ vậy, trong bản điện di trên có 10/15 mẫu âm tính và 5/15 mẫu dƣơng tính
Các kết quả này đƣợc kiểm chứng bằng kỹ thuật siêu âm ở tuần thứ 16 và sau sinh cho kết quả hoàn toàn phù hợp. Đây là kết quả của 30 trƣờng hợp nghiên
cứu ban đầu cho nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ và chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ. Theo nghiên cứu của Zolotukhina, (2005), tách chiết ADN phôi thai trong huyết tƣơng và huyết thanh mẹ xác định giới tính bằng nested PCR qua mồi SRY trên nhiễm sắc thể Y. Độ chính xác qua xác định giới tính là 91,7% [134]. Theo nghiên cứu của Chan và cộng sự, (2004), tách chiết và nghiên cứu nồng độ và phân bố kích thƣớc ADN phơi thai tự do trong máu mẹ cho thấy nồng độ ADN trong máu mẹ chiếm 3,4-6,2% so với ADN tổng số và có kích thƣớc nhỏ, tác giả này cũng đã chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN tự do phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ bằng nhân gen SRY [22]. Bằng kỹ thuật PCR, Costa và cộng sự đã chứng minh đƣợc trong máu ngoại vi của mẹ có ADN của phơi thai lƣu hành, tác giả đã nghiên cứu trên 121 trƣờng hợp phụ nữ mang thai ở tuổi thai trung bình 11,8 tuần kết quả cho thấy trong 121 trƣờng hợp có 61 trƣờng hợp mang thai nam và 60 trƣờng hợp mang thai nữ [49]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới.
Với 30 mẫu máu ngoại vi của các thai phụ với tuổi thai từ 7 đến 9 tuần, kết quả chúng tôi thấy xuất hiện 15 trƣờng hợp mang thai nam dƣơng tính với gen SRY và 15 trƣờng hợp mang thai nữ âm tính với gen SRY, 30 mẫu nghiên cứu này đều dƣơng tính với gen GAPDH, do vậy chúng tơi nhận định rằng các mẫu nghiên cứu đều tách đƣợc ADN phơi thai tự do, các mẫu âm tính với gen SRY là âm tính thật. Từ kết quả trên đây, chúng tôi cũng đã chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu mẹ và các nhận định rằng quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ có cải tiến bằng bộ kít Qiagen đạt kết quả tốt. Kết quả này mở ra một hƣớng mới trong chẩn đốn trƣớc sinh khơng xâm lấn, sử dụng ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để sàng lọc và chẩn đoán sớm trƣớc sinh các bệnh di truyền.