lƣợng NST trƣớc sinh (4 mẫu) Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2.1. Kỹ thuật phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
Nguyên tắc tách hồng cầu có nhân bằng hạt từ tính
Ngày nay, dựa vào đặc tính của từ tính, ngƣời ta đã bắt đầu nghiên cứu ứng dụng trong sinh học, đặc biệt là trong tách chiết protein, ADN và tế bào.
Hình 2.4. Các chất gắn trên bề mặt hạt từ tính
Các đặc tính của hạt từ tính: Có độ phân tán cao, khơng bị kết tủa, có thể làm biến đổi từ trƣờng trong thời gian ngắn, có thể gắn thêm các chất khác trên bề mặt, hiệu quả tự động.
Để phục vụ cho q trình tách chiết, hạt từ tính có thể gắn trên bề mặt các thành phần sau:
Bảng 2.7. Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt hạt từ tính
Chất gắn Công thức Ứng dụng
Silica -SiOH Tách chiết ADN
Carboxyl -COOH Thu hồi protein, Tách chiết ADN
Aldehyde -CHO Thu hồi protein
Amine -NH2 Thu hồi protein
Hydrophobic -C6-C18 Thu hồi protein
Sulfonate -SO3- Trao đổi ion
Sulfhydryl -SH Thu hồi protein
Streptavidin -SAV Tách các phân tử chứa biotin
Protein-A/G -PA/G Tách protein, ví dụ: các IgG
Hồng cầu nhân của phôi thai đã đƣợc gắn với kháng thể theo nguyên tắc kháng nguyên - kháng thể, tiếp đó kháng thể kháng CD71 có gắn Biotin sẽ bắt cặp với hạt từ tính gắn với streptavidin nhờ mối liên kết streptavidin-Biotin rất bền vững.
Dƣới tác dụng của lực từ trƣờng, phức hợp hồng cầu nhân-hạt từ đƣợc hút về 1 cực của nam châm.
Rửa nhiều lần để thu phức hồng cầu nhân-hạt từ. Dùng hóa chất để tách ADN ra từ hồng cầu nhân.
Quy trình tách chiết hồng cầu có nhân bằng hạt từ tính gắn Streptavidin
Kháng thể kháng CD71 đƣợc biotin hóa gắn với hạt từ tính đã đƣợc gắn với Streptavidin. Phức hợp hạt từ trên có CD71 sẽ gắn với hồng cầu nhân của phôi thai theo nguyên tắc miễn dịch.
Cụ thể các bƣớc nhƣ sau: Lấy 10 µl kháng thể đã biotin hóa vào ống 1,5 ml, thêm 20µl hạt từ đã gắn Streptavidin, ủ ở 4oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 100µl PBS 1X, lắc nhẹ, đặt lên giá từ tính hút bỏ hết dịch. Lấy ống ra cho thêm 100µl PBS 1X lắc nhẹ hút vào tube 3ml máu, đạy nắp, tiến hành lắc quay tròn 15 phút ở 4oC. Đặt lên giá từ tính hút bỏ tồn bộ dịch máu, giữ lại phức hợp hạt từ-hồng cầu nhân. Tiếp theo thêm 100µl PBS 1X, lắc đều, đặt lên giá từ, hút bỏ phần dịch lỏng, (làm lại 3 lần). Cuối cùng cho thêm 20µl PBS 1X hịa tan thu lấy tế bào hồng cầu có nhân.