Phƣơng pháp khơng xâm lấn là phƣơng pháp chẩn đốn dựa vào phân tích vật liệu di truyền của thai nhi nhƣng không từ các mẫu xâm lấn vào tử cung buồng ối mà từ vật liệu di truyền thai nhi có trong máu ngoại vi của ngƣời mẹ.
Ngày nay, việc chẩn đoán sớm các dị tật trƣớc sinh là một vấn đề rất quan trọng. Nó góp phần quan trọng cho việc giảm bớt gánh nặng cho xã hội, giảm bớt sự bất hạnh của các gia đình có những đứa trẻ khuyết tật đó. Những gia đình mà bố mẹ mang các di chứng của chất độc Dioxin, những gia đình tiếp xúc nhiều với hóa chất độc hại hay những gia đình gặp khó khăn do việc sinh con muộn thì là những gia đình có tần suất sinh con mắc các dị tật cao. Khi thai nhi càng lớn thì các tai biến do đình chỉ thai ngày càng cao. Do vậy, việc lựa chọn các phƣơng thức và các kỹ thuật dùng cho việc chuẩn đốn sớm rất có ý nghĩa trong việc chẩn đốn trƣớc sinh.
Phƣơng pháp tách ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ đƣợc sử dụng bộ kít MiniBlood của Qiagen (code: 51106) có cải tiến. Các nhà nghiên cứu ADN phơi thai tự do sử dụng bộ kít này để tách ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Sau khi tách chiết, ADN đƣợc dùng để chẩn đoán các bệnh di truyền trƣớc sinh và sàng lọc các bệnh di truyền liên kết với NST giới tính bằng các kỹ thuật nhân gen PCR, kỹ thuật Realtime –PCR.
Lo và cộng sự (1997) đã phát hiện ra sự có mặt ADN tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ. Số lƣợng bản copy của ADN phôi thai tự do nhiều hơn nhiều lần so với các tế bào phơi thai trong máu mẹ, chính vì thế chẩn đốn trƣớc sinh bằng ADN phơi thai tự do có độ nhạy cao hơn so với kỹ thuật lấy tế bào [85].
Hahn và cộng sự (2002), nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai trong máu mẹ góp phần chẩn đốn một số bệnh lý di truyền [73]. Năm 2013 Simpson và cộng sự đã chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ. Tác giả đã ứng dụng ADN phôi thai này để sàng lọc một bệnh nhƣ Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh, sàng lọc bất thƣờng nhiễm sắc thể số 21, sàng lọc các bất thƣờng NST giới tính [116].
Năm 2008, tại Mỹ, Rossa và cộng sự đã sử dụng phân tích ADN phơi thai phát hiện 14 trƣờng hợp Down trong tổng số 28 mẫu dịch ối bằng phƣơng pháp parellel sequencing [108].
Việc chẩn đốn trƣớc sinh qua phân tích ADN phơi thai trong máu mẹ có ƣu điểm nổi trội là không sử dụng các biện pháp xâm lấn thai khi lấy mẫu nhƣ chọc hút dịch ối, sinh thiết gai nhau, lấy máu cuống rốn, do vậy tránh đƣợc các tai biến nhƣ sẩy thai, tổn thƣơng thai… Nhƣng nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là vật liệu di truyền ADN đƣợc tách ra có lẫn ADN của mẹ, do vậy kỹ thuật chẩn đoán di truyền qua ADN phôi thai tự do trong máu mẹ chỉ chẩn đoán đƣợc một số bệnh do gen nằm trên nhiễm sắc thể Y hoặc bất thƣờng di truyền nhóm máu Rh giữa mẹ và con và bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thƣờng.
Tùy thuộc vào loại bệnh, tính chất gen đột biến mà có sự lựa chọn phƣơng pháp xâm lấn hay không xâm lấn cho phù hợp có giá trị chẩn đốn và có lợi cho ngƣời bệnh nhất.
Hiện nay, phƣơng pháp chẩn đốn trƣớc sinh khơng xâm lấn (NIPT - Non invasive prenatal test) sử dụng mẫu máu phân biệt kiểu gen của ngƣời mẹ và thai nhi với kết quả có độ chính xác cao ngay cả khi hàm lƣợng ADN tự do của thai nhi trong máu mẹ ở mức thấp. Phƣơng pháp sàng lọc này áp dụng trên những bà mẹ mang thai 10 tuần tuổi hoặc thai kỳ lớn hơn với những trƣờng hợp mang thai có một trong các yếu tố sau: Tuổi mang thai muộn (>35 tuổi), siêu âm có bất thƣờng, có tiền sử nguy cơ với nhiễm sắc thể 21, 18, 13 hoặc đột biến lệch bội nhiễm sắc thể giới tính. Xét nghiệm này có độ chính xác cao có tỷ lệ phát hiện hội chứng Down từ 98,6-100%, chỉ có 0-2,1% là dƣơng tính giả [98]. Theo nghiên cứu của Lau và cộng sự (2014) cho thấy kỹ thuật NIPT cho độ nhạy lơn hơn 99% với hội chứng Down, có khả năng phát hiện với trisomy 18 là 100% và trisomy 13 là 91,7% [81].
Tất cả các xét nghiệm NIPT chỉ là xét nghiệm sàng lọc, chƣa thể đƣa ra một kết luận chắc chắn về tình hình thực tại của thai, nó chỉ có thể khẳng định bằng chẩn đốn xác định qua phân tích vật liệu di truyền từ tế bào của thai qua chọc hút nƣớc ối hoặc sinh thiết nhau thai. Trong hầu hết các nghiên cứu đã công bố cho thấy sau khi test sàng lọc NIPT dƣơng tính thì lời khun di truyền tiếp theo cho các thai phụ là chẩn đoán xác định thai dị tật bằng kỹ thuật xâm lấn. Tùy từng kỹ thuật NIPT khác nhau mà giá trị của test sàng lọc về độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau ví dụ nhƣ các test Verifi, Harmony, Panorama, MaterniT21 Plus [93]. Nhƣợc điểm của xét nghiệm sàng lọc này là không sàng lọc đƣợc nguy cơ dị tật ống thần kinh và dị tật thành bụng.
Bảng 1.1. Thống kê so sánh 4 sản phẩm thương mại của kỹ thuật NIPT [93]
Kết quả MaterniT21 Plus Verifi Harmony Panorama
Độ nhạy 98,6-99% (209/212) >99% (90/90) 100% (81/81) >99% (25/25) Độ đặc hiệu 99,8% (1468/1471) 99,8% (409/410) 99,97% (2887/2888) >99% (242/242) Dƣơng tính giả 0,2% (3/1471) 0,2% (1/140) 0,03% (1/2888) 0% Khơng có kết quả 3,4% 5,8% 4,7-5,7% 5,4%
Theo nghiên cứu của Willems và cộng sự (2014) khi nghiên cứu trên 3000 mẫu ADN phôi thai tự do của các thai phụ cho thấy tỷ lệ dƣơng tính giả sử dụng kít Harmony là nhỏ hơn 0,1% [132]. Nghiên cứu của tác giả Cullough và cộng sự (2014) trên 100.000 mẫu sử dụng kỹ thuật NIPT với bộ kít thƣơng mại MaterniT21Plus thấy rằng kỹ thuật NIPT này có độ nhạy rất cao, khả năng sàng lọc các mẫu có mang dị tật rất tốt >98% [51]. Hiện nay, cũng có nhiều phịng thí nghiệm sử dụng kỹ thuật NIPT để sàng lọc các dị tật trƣớc khi sinh, nhƣ nghiên cứu của Fairbrother và cộng sự năm 2013 cho thấy kỹ thuật này có độ chính xác lên tới 98,6% [61]. Chetty và cộng sự (2013) đã sử dụng kỹ thuật NIPT để sàng lọc trƣớc sinh các dị tật cho thấy độ chính xác của kỹ thuật này là khoảng 99% với hội chứng Down, 97% với hội chứng trisomy 18 và kết quả có thể có sau 2-3 ngày, nhƣng giá thành của kỹ thuật này khá đắt [42]. Nghiên cứu của Buchanan và cộng sự 2014 cũng đã dùng kỹ thuật NIPT để sàng lọc các dị tật liên quan đến nhiễm sắc thể số 13, 18, 21 với độ chính xác của kỹ thuật rất cao (chỉ có <1/1.000 trƣờng hợp dƣơng tính giả [36]. Kỹ thuật này cũng không phải là kỹ thuật chính xác hồn tồn để những trƣờng hợp dƣơng tính với kỹ thuật NIPT có thể đình chỉ thai, theo nghiên cứu của Dugo và cộng sự năm 2014 thấy rằng có 6 trƣờng hợp dƣơng tính giả khi sử dụng kỹ thuật này (kết quả của NIPT là 2 hội chứng 45,X; 2 hội chứng 47,XXX;
1 hội chứng Patau, 1 hội chứng Edwards) sau khi các trƣờng hợp này dƣơng tính có sử dụng kỹ thuật sinh thiết nhau thai và dịch ối để kiểm tra thấy các thai này bình thƣờng khơng bi đột biến nhiễm sắc thể [56].
Theo tác giả Morain và cộng sự khi thống kê và nghiên cứu các bộ kít thƣơng mại đã đƣợc sử dụng ở Mỹ cho thấy các bộ kít này có những ƣu nhƣợc điểm khác nhau (thể hiện bảng 1.2 dƣới đây) [95]:
Bảng 1.2. Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ [95]
Test (Công ty) Năm sử dụng Dị tật trƣớc sinh sàng lọc Giá thành Độ nhạy Độ đặc hiệu Verifi (Verinata) 2/2012 Trisomy 13, 18, 21; bất thƣờng NST giới tính (X; XXX; XXY; XYY), một số bệnh liên kết với giới tính (Hemophilia, DMD, Ambigous genitalia) 1.200$ Trisomy 21, >99% Trisomy 18, 97,4% Trisomy 13, 87,5% Trisomy 21, 99,8% Trisomy 18, 99,6% Trisomy 13, >99,9% MaterniT21 (Sequenom) 10/2011 Trisomy 13, 18, 21 và xác định giới tính 2.762$ Trisomy 21, 99,1% Trisomy 18, >99,9% Trisomy 13, 91,7% Trisomy 21, 99,9% Trisomy 18, 99,6% Trisomy 13, 99,7% Harnmony (Ariosa) 5/2012 Trisomy 13, 18, 21 795$ Trisomy 21, 99,9% Trisomy 18, >98,1% Trisomy 13, 80,0% Trisomy 21, 99,0% Trisomy 18, 99,0% Trisomy 13, 99,0% Panorama (Natera) 12/2012 Trisomy 13, 18, 21, monosomy X, XXX, XXY, XYY 1.495$ Trisomy 21, 100% Trisomy 18, 100% Trisomy 13, 100% Trisomy 21, 100% Trisomy 18, 100% Trisomy 13, 100%
b. Phân tích di truyền tế bào phơi thai lƣu hành trong máu mẹ
Có rất nhiều phƣơng pháp tách tế bào phơi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ: Phân loại tế bào đƣợc kích hoạt huỳnh quang (FACS: Fluorescence- activated cell sorting) và phân loại tế bào kích hoạt từ tính (MACS: magnetic
activated cell sorting) là hai hệ thống thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất đối với việc phân loại tế bào có gắn kháng thể. Các tế bào tách chiết đƣợc sẽ đƣợc lai tại chỗ huỳnh quang (FISH) để chẩn đoán các bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể 13, 18, 21 và X, Y.
FACS: Herzenberg và cộng sự, (1979) là ngƣời đầu tiên đã sử dụng FACS. Những ƣu điểm của kỹ thuật là khả năng làm giàu tế bào với độ tinh khiết cao, thực hiện phân loại đa thông số tức là đồng thời phân tích một số tiêu chí trên một tế bào duy nhất, và đƣợc điều chỉnh cho việc sử dụng với các kháng nguyên trong tế bào chất [75]. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là chi phí đắt tiền, yêu cầu nhân viên phịng thí nghiệm đƣợc đào tạo đặc biệt, giới hạn về số lƣợng của các tế bào có thể đƣợc đƣa vào hệ thống trong một khoảng thời gian nhất định vì các tín hiệu huỳnh quang sẽ mờ dần nếu đƣợc đánh dấu bằng chất huỳnh quang và việc mất tế bào trong quá trình nhuộm huỳnh quang (Wang và cộng sự, 2000)[131].
MACS: Việc sử dụng kỹ thuật MACS chẩn đoán tiền sản không xâm lấn lần đầu tiên đƣợc đề xuất bởi Ganshirt-Ahler và cộng sự (1992) [66], [67]. Kỹ thuật này nhanh hơn, ít tốn kém, phù hợp để xử lý số lƣợng tế bào lớn và có thể đƣợc thực hiện ở hầu hết các phịng thí nghiệm mà khơng cần nhân viên đƣợc đào tạo và chi phí bảo dƣỡng cao. Nhƣợc điểm chính là lựa chọn tế bào có thể dựa trên chỉ một tiêu chuẩn duy nhất. Lựa chọn âm tính và dƣơng tính có thể thực hiện trên tổng số các tế bào trong các thí nghiệm tƣơng tự nhƣng việc làm giàu cần phải đƣợc thực hiện cùng một lúc. Nhƣợc điểm là: độ tinh khiết thấp so với FACS, các tiêu bản có lẫn nhiều tế bào mẹ hơn (Wang và Cộng sự, 2000)[131]. Tuy nhiên, chắc chắn các tế bào của thai nhi đều tách đƣợc.
Walknowska và cộng sự, 1969 đã phát hiện ra sự có mặt của tế bào phơi thai trong máu ngoại vi của mẹ. Đây là phát hiện vơ cùng quan trọng, vì nó cho phép tách đƣợc vật liệu di truyền của thai nhi bằng cách xét nghiệm máu của mẹ (không hề xâm lấn tới thai nhi nhƣ các phân tích di truyền của thai nhi kinh điển), từ đó mở ra hƣớng mới đầy triển vọng trong chẩn đốn trƣớc sinh bằng biện pháp khơng xâm lấn[130].
Poon và cộng sự (2000) đã ứng dụng thành cơng kỹ thuật FISH để phân tích di truyền các tế bào phôi thai trong máu mẹ cho 3 ca trisomy 21. Kết quả: 100% số ca mang thai bị hội chứng Down đã đƣợc phát hiện. Kỹ thuật FISH cho phép bỏ qua bƣớc nuôi cấy tế bào (mất khoảng 2 tuần) cho phép phân tích đƣợc bất thƣờng NST chỉ trong vòng 24-48h.
Bischoff và cộng sự, (2003) tổng kết mặc dù cịn nhiều khó khăn trong việc tách chiết các tế bào phơi thai chiếm tỉ lệ rất ít trong máu của mẹ, tỉ lệ phát hiện đƣợc hội chứng Down trong các nghiên cứu khi sử dụng phƣơng pháp này là 50- 75% [34].
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là thu đƣợc tế bào của thai nhi tách riêng biệt khỏi máu ngoại vi của mẹ, từ đó có thể áp dụng các kỹ thuật sinh học tế bào hoặc sinh học phân tử để chẩn đoán các bệnh di truyền và DTBS. Tuy nhiên, phƣơng pháp phân tích di truyền trên tế bào phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ có nhƣợc điểm là số lƣợng tế bào thấp. Bên cạnh FISH, một số kỹ thuật khác cũng đã đƣợc ứng dụng trong phân tích di truyền chẩn đốn trƣớc sinh, đó là: CGH (comparative genome hybridization), kỹ thuật PCR và QF-PCR.