2.1. NỘI DUNG 1:
PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ XÁC ĐỊNH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ NGƯỜI TỪ MÔ MỠ NGƯỜI
2.1.1. Thu nhận mô mỡ người Cơ sở khoa học: Cơ sở khoa học:
Mơ mỡ có thể bị nhiễm khuẩn trong quá trình thu nhận và vận chuyển về Phịng thí nghiệm. Do đó, thu nhận và bảo quản được mẫu mơ mỡ vơ trùng là tiêu chí đầu tiên được đưa ra để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu.
Tiêu chuẩn chọn mẫu (theo tiêu chuẩn của FACT-JACIE):
Được sự đồng ý của người cho mẫu (người hiến), có kèm phiếu cam kết tham gia nghiên cứu (phụ lục)
Mẫu mô được thu nhận trong điều kiện vô trùng
Mẫu được thu nhận tại các vùng mô lành, không bị dập nát, không bị tổn thương
Tiêu chuẩn loại trừ:
Mẫu mơ bị nhiễm trùng
Người hiến có các xét nghiệm dương tính với một trong những xét nghiệm HIV, HBV, HCV, VDRL
Mẫu bảo quan quá lâu ( > 8 tiếng ) trong tủ bảo quản 40C
Phương pháp tiến hành
Mô mỡ được thu nhận trong trường hợp hút mỡ (trong phẫu thuật thẩm mỹ) từ các vùng mô mỡ thừa trong điều kiện vô trùng tại Bệnh viện.
Sau khi thu nhận, mẫu mơ mỡ được giữ trong lọ vơ trùng có chứa mơi trường bảo quản mẫu DMEM/F12 có bổ sung kháng sinh (Pen/Strep) và nhanh chóng chuyển mẫu về phịng thí nghiệm. Mẫu mơ có thể được giữ qua đêm ở nhiệt độ 40
C.
Đánh giá sự nhiễm khuẩn bằng cách quan sát môi trường nuôi mẫu. Nếu môi trường nuôi trở nên đục và đổi màu sau 3 ngày thì tiến hành đi kiểm tra vi sinh để đánh giá tình trạng nhiễm của mẫu.
Chỉ tiêu đánh giá: Mẫu mô không bị nhiễm khuẩn
2.1.2. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ người Cơ sở khoa học: Cơ sở khoa học:
Mô mỡ là một trong những loại mô ở cơ thể trưởng thành được xác định là có chứa các tế bào gốc trưởng thành (tế bào gốc trung mô). Các tế bào gốc này sau khi được
27
phân lập, ni cấy sẽ bám dính và tăng sinh trên bề mặt đĩa ni cấy. Sau một thời gian nuôi cấy, những tế bào không bám dính hay khả năng tăng sinh hạn chế sẽ bị loại bỏ dần. Các tế bào bám dính và tăng trưởng cịn lại sẽ biểu hiện các marker đặc trưng của dịng tế bào gốc trung mơ.
Phương pháp tiến hành:
Mẫu mô mỡ được cắt thành những mảnh nhỏ và ủ trong dung dịch enzyme collagenase-Dispase ở nhiệt độ 37oC.
Dịch tế bào được thu nhận và quay ly tâm. Tiếp theo, cặn tế bào được huyền phù, lọc qua phễu lọc (Cell Strainer) có đường kính 70 µM và quay ly tâm 3000 vịng/phút trong 5 phút.
Sau đó, cặn tế bào được huyền phù với mơi trường ni DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum), xác định mật độ tế bào sống bằng cách sử dụng thuốc nhuộm trypan blue và nuôi ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.