C, 5% CO2 Vì khung G-A có cấu trúc lỗ xốp nên các tế bào sau khi được chuyển lên khung và nuôi trong mơi trường phù hợp sẽ di cư, bám dính và
3. Định nghĩa và một số thuật ngữ G-A: Gelatin-Alginate
G-A: Gelatin-Alginate
EDC: 1-etyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
4. Nguyên tắc
Để tạo cấu trúc định hình giữa gelatin và alginat, tác nhân khâu mạch EDC được sử dụng do EDC khơng gây độc và có tính tương hợp sinh học cao. EDC khâu mạch thông qua sự tạo thành liên kết amide hay liên kết ester giữa nhóm hydroxyl và carboxyl nhưng không hợp nhất vào cấu trúc xốp. Sự khâu mạch có thể xảy ra giữa cấu trúc alginat và gelatin hoặc cũng có thể xảy ra trong nội bộ từng cấu trúc gelatin và alginat. Các nhóm carboxyl của alginate hoặc gelatin phản ứng với EDC tạo thành urea hòa tan.
5. Biện pháp phịng ngừa an tồn
Xử lý tất cả các thành phần của hóa chất xem như là những vật liệu gây độc. Đeo khẩu trang, mang găng sạch và găng vơ trùng trong q trình vận chuyển và thao tác xử lý mẫu.
3 6. Thiết bị và vật liệu 6.1. Thiết bị DTX 880 (Beckman Coulter) Tủ lạnh -200C (Sanyo) Tủ lạnh -800C (Sanyo) Nồi hấp khử trùng (Nuaire) 6.2. Vật liệu
Tube quay ly tâm 15 ml, 50 ml (Corning) Pasteur pipette (Wheaton)
Găng sạch (MERUFA) Găng vô trùng (MERUFA) Bơm tiêm (Vinahankook) Đĩa petri Màng lọc 0.2um Becher 50, 100, 250ml Ependorff Đầu type 1000 µl Đầu type 100µl
Pipetman 10 - 1000µL (Gilson, The Netherlands) Bình định mức (100ml, 250ml, 500ml) 6.3. Hóa chất PBS (Gibco) DMSO (Sigma) Glutaraldehyde 2,5% (Sigma) Gelatin 1% (Sigma) Alginate 1% (Sigma) Ethanol (Merck)
4 Nước cất
7. Mẫu nghiên cứu
Tất cả hóa chất tạo khung G-A được mua từ các cơng ty cung cấp hóa chất. Bảo quản và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
8. Quy trình tạo khung G-A
Gelatin và Alginate được hòa tan trong nước cất ở 500C để được dung dịch gelatin 1% và dung dịch alginate 1%.
Hoà trộn 2 dung dịch theo các tỉ lệ G:A là 7:3, 8:2, 9:1 và hút 10ml mỗi tỉ lệ cho vào falcon 50ml, ủ ở -80oC trong 24 giờ.
Tiếp theo, các khối đông lạnh này được ngâm trong 40ml dung dịch EDC 0,3% ở điều kiện 4oC, tránh sáng để tiến hành khâu mạch.
Sau 24 giờ, gắp các mẫu ra và mang đi đơng khơ.
Bao bì, đóng gói.
Sau khi đơng khơ, khung nâng đỡ được đóng gói rồi khử trùng chiếu xạ ở liều 25kGy.
Bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng.
9. Đánh giá kết quả
Quy trình trên có tỉ lệ thành cơng trên 90%, khung G-A có thể được đánh giá bởi một số đặc điểm sau:
- Cấu trúc lỗ xốp của khung G-A được đánh giá dựa vào kết quả nhuộm H&E (để đánh giá cấu trúc của khung) và ảnh chụp SEM (để đánh giá bề mặt của khung). - Độ hấp thu nước của khung G-A phụ thuộc vào tính chất của các thành phần
cũng như độ xốp của khung. Độ hấp thu nước được xác định dựa vào sự tăng khối lượng của khung nâng đỡ khô sau khi ngâm trong nước.
5
- Thử nghiệm độc tính nhằm kiểm tra khả năng gây độc của khung nâng đỡ với tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009.
- Đánh giá tính tương hợp sinh học của khung bằng cách ghép khung G-A vào dưới da lưng chuột thí nghiệm và đánh giá các chỉ tiêu về mặt mô học và số lượng bạch cầu tổng.
10. Tài liệu tham khảo
1. Andersen T., Strand B. L., Formo K., et al (2012). Chapter 9 Alginates as Biomaterials in
Tissue Engineering. In Carbohydrate Chemistry: Volume 37, 37, 227-258: The Royal
Society of Chemistry.
2. Mashhadikhan M, Soleimani M, Parivar K, Yaghmaei P. (2015). ADSCs on PLLA/PCL Hybrid Nanoscaffold and Gelatin Modification: Cytocompatibility and Mechanical Properties, Avicenna J Med Biotechnol, 7(1):32-8.
3. Sun Jinchen and Tan Huaping (2013). Alginate-Based Biomaterials for Regenerative Medicine Applications. Materials, 6(4):1285-1309.
4. Yin F, Cai J, Zen W, Wei Y, Zhou W, Yuan F, Singh SR, Wei Y (2015). Cartilage Regeneration of Adipose-Derived Stem Cells in the TGF-β1-Immobilized PLGA-Gelatin Scaffold. Stem Cell Rev, 11(3):453-9.
5. Young Seon Choi, Sung Ran Hong, Young Moo Lee, Kang Won Song, Moon Hyang Park, Young Soo Nam (1999) Studies on gelatin-containing artificial skin: II. Preparation and characterization of cross-linked gelatin-hyaluronate sponge. Biomaterials, 409-417.
1