C, 5% CO2 Vì khung G-A có cấu trúc lỗ xốp nên các tế bào sau khi được chuyển lên khung và nuôi trong mơi trường phù hợp sẽ di cư, bám dính và
8. Quy trình thực hiện
8.1. Quy trình phân lập và ni cấy tế bào gốc từ mô mỡ
Mẫu mô mỡ được cắt thành những mảnh nhỏ và ủ trong dung dịch enzyme collagenase-Dispase ở nhiệt độ 37oC.
Dịch tế bào được thu nhận và quay ly tâm. Tiếp theo, cặn tế bào được huyền phù, lọc qua phễu lọc (Cell Strainer) có đường kính 70 µM và quay ly tâm 3000 vịng/phút trong 5 phút.
Sau đó, cặn tế bào được huyền phù với mơi trường ni DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum), xác định mật độ tế bào sống bằng cách sử dụng thuốc nhuộm trypan blue và nuôi ủ trong tủ ấm 37o
C, 5% CO2. CO2.
6 Khi tế bào tăng sinh khoảng 80% diện tích bề mặt chai ni, các tế bào được cấy chuyền sang chai nuôi mới bằng cách ủ với trypsin/EDTA trong 5 phút ở 37oC. Sau đó bổ sung mơi trường ni DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS và huyền phù để tách tế bào khỏi bề mặt chai nuôi, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, huyền phù cặn trong môi trường nuôi và nuôi ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
Môi trường được thay mới 2 ngày một lần.
Tồn bộ q trình được tiến hành trong điều kiện vơ trùng.
8.2. Quy trình định danh tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ
Để định danh tế bào, ở lần cấy chuyền thứ hai, tế bào được đánh giá theo tiêu chuẩn ISCT:
- Dựa vào hình thái:
Tiến hành nhuộm tế bào với thuốc nhuộm giemsa gồm: + 3 ml Giemsa solution
+ 3 ml Methanol + 4 ml Aid Citric + 8 ml Na2HPO4
+ Bổ sung nước cất cho đủ 200 ml. Quy trình nhuộm:
+ Loại bỏ mơi trường củ.
+ Rửa lại 3 lần bằng dung dịch PBS
+ Cố định tế bào bằng dung dịch NFB 10% trong 45 phút. + Loại bỏ dung dịch cố định và rửa 3 lần với dung dịch PBS. + Bổ sung 5 ml dung dịch nhuộm Giemsa trong 15 phút. + Rửa lại bằng nước cất.
7
- Dựa vào tiềm năng biệt hóa:
+ Tiến hành biệt hóa tạo xương bằng hỗn hợp môi trường gồm DMEM/F12, FBS, Pen/strep, Dexamethasone, Ascorbic acid, Beta-glycerol phosphate, Vitamin D2, FGF-9. Nhuộm Alkaline phosphatase để đánh giá khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương.
Quy trình nhuộm alkaline phosphatase:
Thuốc nhuộm:
Naphthol AS MX-PO4 0.005 g
N,N-Dimethylformamide (DMF) 200 PL
0.2 M Tris-HCL pH 8.3 25 mL
Red Violet LB salt 0.03 g
Distilled water 25 mL Quy trình:
1. Loại bỏ mơi trường ni, rửa lại với PBS lạnh. 2. Cố định tế bào với NFB 10% lạnh trong 45 phút.
3. Loại bỏ dung dịch cố định và rửa lại với nước cất 3 lần. 4. Loại bỏ nước rửa và để yên 15 phút.
5. Nhuộm với thuốc nhuộm trong 45 phút trong điều kiện tối
Kết quả: Tế bào dương tính với alkaline phosphatase bắt màu màu hồng đậm.
+ Tiến hành biệt hóa tạo mỡ bằng môi trường StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco™). Nhuộm Oil red O để đánh giá khả năng tạo mỡ.
Thuốc nhuộm:
Oil red O: 300mg Isopropanol: 100ml
Quy trình:
1. Loại bỏ môi trường nuôi, rửa lại với PBS lạnh. 2. Cố định tế bào với NFB 10% lạnh trong 45 phút.
8
3. Loại bỏ dung dịch cố định và rửa lại với nước cất 3 lần. 4. Loại bỏ nước rửa và để yên 15 phút.
5. Nhuộm với thuốc nhuộm trong 15 phút.
Kết quả: Tế bào dương tính với Oil Red bắt màu màu đỏ đậm bên trong bào tương.
+ Tiến hành biệt hóa tạo sụn bằng mơi trường StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco™). Nhuộm Alcian blue để đánh giá khả năng tạo sun. Thuốc nhuộm:
- 60 ml Ethanol (98 - 100%) - 40 ml Acetic Acid (98 - 100%) - 10 mg Alcian Blue 8 GX Quy trình:
1. Loại bỏ mơi trường ni, rửa lại với PBS lạnh. 2. Cố định tế bào với NFB 10% lạnh trong 45 phút.
3. Loại bỏ dung dịch cố định và rửa lại với nước cất 3 lần. 4. Loại bỏ nước rửa và để yên 15 phút.
5. Nhuộm với thuốc nhuộm trong 15 phút.
Kết quả: Tế bào dương tính với Alcian blue bắt màu màu xanh dương.
- Dựa vào khả năng biểu hiện marker bề mặt.
Chạy Flow cytometry với các marker CD105, CD90, CD73, CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79a or CD19, HLA-DR để đánh giá sự biểu hiện của các marker này. Dương tính (95%) và âm tính (2%). Kiểu hình miễn dịch của MSC: CD105, CD90, CD73 dương tính và các marker CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79a or CD19, HLA-DR âm tính.
9