C, 5% CO2 Vì khung G-A có cấu trúc lỗ xốp nên các tế bào sau khi được chuyển lên khung và nuôi trong mơi trường phù hợp sẽ di cư, bám dính và
CHƯƠNG 3: KẾTQUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.3. Định danh tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ ngườ
Dựa vào các tiêu chí của International Society Cell Therapy (ISCT) đã đưa ra các nguyên tắc chung để định danh một tế bào gốc được gọi là tế bào gốc trung mô người [14]:
Một là khả năng bám dính, tăng sinh và hình thái đặc trưng của tế bào trên bề mặt của dụng cụ nuôi cấy.
Hai là các tế bào phải có kết quả phân tích dương tính với các marker CD90, CD73, CD105 và phải có kết quả phân tích âm tính đồng thời với các marker CD34, CD14, CD45 và HLA-DR. Và cũng theo ISCT thì một marker được xem là âm tính đối với dịng tế bào đem đi định danh khi tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính ở mức không quá 2% (≤2%) trong tổng số tế bào khảo sát. Ngược lại, một marker được xem là dương tính đối với dòng tế bào đem đi dịnh danh khi tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính từ mức 95% trở lên ( ≥95% ) trong tổng số tế bào khảo sát.
Ba là các tế bào này phải có khả năng biệt hóa thành một số loại tế bào khác nhau, cụ thể ba loại tế bào: tế bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn.
Dựa vào khả năng bám dính với bề mặt chai ni
Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết quả cho thấy các tế bào thu nhận từ mơ mỡ có khả năng bám dính trên bề mặt của dụng cụ ni cấy (Hình 3.11) và tăng sinh mạnh mẽ (đồ thị 3.1). Hình thái của các tế bào này rất giống với hình thái nguyên bào sợi của tế bào có nguồn gốc từ phần trung mơ (Hình 3.11)
Dựa vào khả năng biệt hóa của tế bào gốc từ mơ mỡ
Biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ thành nguyên bào xương
Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào bằng mơi trường tạo xương, tế bào bắt đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài giống với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt đầu xuất hiện dạng hình thái đa diện và chế tiết chất nền xương. Trong chai nuôi xuất hiện các nốt xương là dạng kết tựu chất nền xương đặc trưng trong in vitro (nhuộm von
42
Alkaline phosphatase (AP), là một trong những marker được sử dụng để đánh giá kết quả biệt hóa tạo tế bào xương của dịng tế bào gốc trung mơ.
Biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ thành tế bào mỡ
Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào bằng mơi trường tạo tế bào mỡ, tế bào bắt đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài giống với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt đầu xuất hiện dạng hình trịn, bên trong bào tương bắt đầu xuất hiện các hạt lipid nhỏ. Sau đó, bên trong bào tương tế bào các hạt lipid tiếp tục kết tựu vào nhau để tạo thành các hạt lipid lớn hơn và chiếm gần hết bào tương tế bào, nhân tế bào bị đẩy ra phía ngoại vi. Tiến hành nhuộm Oil Red O, các tế bào dương tính xuất hiện với bên trong chứa rất nhiều hạt lipid bắt màu đỏ. Đặc điểm đặc trưng cho tế bào mỡ.
Biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ thành tế bào sụn
Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào bằng mơi trường tạo tế bào sụn, tế bào bắt đầu thay đổi hình thái từ hình dạng thon dài giống với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt đầu xuất hiện dạng hình trịn, đa diện và bắt đầu chế tiết chất nền sụn. Sau 14 ngày ni cấy, các tế bào biệt hóa biểu hiện được chất nền sụn thông qua chất phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alcian blue. Các chất nền sụn dương tính với thuốc nhuộm tạo ra màu xanh dương đặc trưng.bằng việc thể hiện màu xanh dương đặc trưng.
Hình 3.12: Đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô. Tế bào sau một
thời gian nuôi trong các loại môi trường cảm ứng biệt hóa phù hợp (mơi trường cảm ứng biệt hóa tạo xương, tạo mỡ và tạo sụn). Sau 14 ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá
Alkaline phosphatase staining Oil red O staining Alcian blue staining
10X 10X 10X 10X 10X 10X 10X Mẫu chứng Mẫu chứng Mẫu chứng A B C D E F
43
khả năng biệt hóa của tế bào qua các phương pháp nhuộm khác nhau lần lượt cho tế bào xương (nhuộm alkaline phosphatase) (A), cho tế bào mỡ (nhuộm Oil red O) (B) và cho tế bào sụn (nhuộm alcian blue) (C). Kết quả cho thấy tế bào gốc trung mơ được thu nhận từ mơ mỡ có khả năng biệt hóa thành tế bào mục tiêu sau khi được cảm ứng bằng quy trình ni phù hợp. (D), (E) và (F) lần lượt là các mẫu chứng, đây là mẫu chỉ có các tế bào gốc trung mơ được nuôi trong môi trường cơ bản, không cảm ứng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn.
Kết quả nghiên cứu này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Yaling Shi và cộng sự [75]. Trong nghiên cứu của tác giả Yaling Shi và cộng sự, nhóm nghiên cứu cũng tiến hành thu nhận tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ và sau đó thử nghiệm biệt hóa các tế bào gốc trung mơ này thành các tế bào xương, sụn và mỡ.
Nhìn chung, kết quả mà nhóm nghiên cứu của chúng tơi thực hiện khơng có nhiều sự khác biệt so với các nhóm nghiên cứu khác mà cụ thể là khi so sánh với nhóm nghiên cứu của Yaling Shi (75). Trong nghiên cứu này, tác giả Yaling Shi và CS đã tiến hành thu nhận MSC từ mô mỡ và tiến hành khảo sát tiềm năng biệt hóa của các MSC thu nhận từ mơ mỡ. Tác giả đã tiến hành biệt hóa các MSC thành tế bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn. Kết quả được cho trong hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quả nghiên cứu biệt hóa MSC từ mô mỡ của tác giả Yaling Shi.
(A). Kết quả nhuộm Alizarin Red S chứng minh có sự hình thành xương sớm. (D). Nhóm chứng khơng cho thấy có sự hình thành xương. Các hạt mỡ xuất hiện trong mẫu được biệt hóa tạo mỡ (B), được nhuộm với Oil red O. (E). Mẫu chứng không cho thấy xuất hiện tạo mỡ. Proteoglycan được tạo ra bởi các ASC nuôi trong môi trường tạo sụn (C), được nhuộm với Alcian Blue. (F). Mẫu chứng không cho thấy tạo sụn (75).
44
Dựa vào khả năng biểu hiện các protein marker bề mặt
Tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai, sẽ được thu nhận bằng enzyme Trypsin-EDTA (0.25% - 0.02%). Sau đó, tế bào sẽ được thu nhận bằng cách quay ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào sẽ được rửa 2 lần với dung dịch PBS để tinh sạch và để huyền phù tế bào thành các tế bào đơn nhằm phục vụ khảo sát các marker bề mặt tế bào bằng kỹ thuật Flow Cytometry (đếm tế bào dòng chảy) để khảo sát sự biểu hiện cũng như không biểu hiện của một số marker bề mặt của tế bào gốc trung mô.
Kết quả được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM) và tại Khoa Miễn dịch, BV. Truyền Máu Huyết Học TP.HCM.
Kết quả thực hiện tại Phòng Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc trên 3 dịng tế bào được ni cấy tại thời điểm lần cấy chuyền thứ hai, mỗi dòng tế bào được khảo sát lặp lại 3 lần với kết quả cho thấy quần thể tế bào đang khảo sát biểu hiện một số marker với CD panel: CD105, CD90, CD73, CD45, CD44 và HLA-DR. Kết quả thực hiện Flow Cytometry được cho trong bảng 3.3 sau đây:
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự biểu hiện của các marker bề mặt từ quần thể tế bào nuôi
từ mô mỡ người (mẫu đại diện) được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc. STT Loại CD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình (%) Độ lệch chuẩn (%) 1 CD73 97,70 97,33 97,44 97,49 0,19 2 CD90 99,46 99,64 99,66 99,59 0,11 3 CD105 99,36 99,31 99,24 99,30 0,06 4 CD44 99,46 99,46 99,60 99,51 0,08 5 HLA-DR 0,31 0,31 0,23 0,28 0,05 6 CD45 0,26 0,25 0,22 0,24 0,02
45
Hình 3.14: Kết quả phân tích marker cho quần thể tế bào gốc từ mô mỡ. Kết quả phân tích cho thấy, quần thể
tế bào âm tính hồn tồn với các marker CD45 và HLA- DR (biểu hiện dương tính khơng q 2%). Tế bào dương tính hồn tồn với các marker CD44, CD73, CD90 và CD105 (biểu hiện dương tính trên 95%).
Kết quả được thực hiện tại Khoa Miễn dịch, BV. Truyền Máu Huyết Học TP.HCM với 3 dịng tế bào được ni cấy tại thời điểm lần cấy chuyền thứ hai, mỗi dòng tế bào được khảo sát lặp lại 3 lần với CD panel: CD45, CD34, CD5, CD19, CD22, CD13, CD14, CD33, CD36, CD105, CD73, CD90. Trên thiết bị BD.FACS Canto II (2-laser, 6-color).
Kết quả phân tích cho thấy có quần thể tế bào (# 99,8%) có sự biểu hiện và khơng biểu hiện các marker phù hợp với đặc điểm của tế bào gốc trung mơ. Tiếp tục phân tích quần thể tế bào này, nhận thấy đặc điểm các marker được thể hiện như sau: (tỉ lệ tính trên tồn bộ tế bào) (bảng 3.7). (Xem kết quả thực hiện trên 3 dòng tế bào trong phần phụ lục).
46
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sự biểu hiện của các marker bề mặt từ quần thể tế bào nuôi
từ mô mỡ người (mẫu đại diện) được thực hiện tại Khoa Miễn dịch, BV. Truyền Máu Huyết Học TP.HCM.
CD % CD %
o CD45 Neg o CD73 99,80
o CD105 98,30 o CD34, CD19 -
o CD90 99,80 o CD11b, HLA-DR -
Hình 3.15. Kết quả phân tích marker dùng để định danh tế bào gốc từ mô mỡ. Kết
quả cho thấy một quần thể tế bào có kiểu hình: CD45NegCD73+CD90+CD105+.
Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ đã phân lập được và nuôi cấy ở lần cấy chuyền thứ hai. Chúng tôi đã đánh giá các chỉ tiêu để xác định cho MSC, kết quả cho thấy các tế bào nuôi cấy đều là các tế bào bám dính trên chai ni, có hình dạng thon dài đặc trưng cho tế bào gốc trung mô.
Thứ hai, quần thể tế bào này có khả năng biệt hóa được thành 3 dịng tế bào khác nhau thuộc nguồn gốc trung mơ đó là ngun bào xương, ngun bào sụn và tế bào mỡ với phương pháp xác định đáng tin cậy chứng tỏ tế bào có tiềm năng biệt hóa được thành các dịng tế bào khác cũng như so sánh với các tác giả khác thấy kết quả nghiên cứu tương đối giống nhau.
Thứ ba, chúng tôi đã khảo sát sự biểu hiện của các marker dùng để xác định cho quần thể MSC từ mô mỡ, phương pháp phân tích dựa trên kỹ thuật đếm tế bào bằng
47
phương pháp dòng chảy (Flow Cytometry). Kết quả cho thấy tế bào dương tính khá cao (trên 95%) với các marker được CD73, CD90 và CD105. Đây là ba marker phổ biến được chấp thuận để xác định cho các MSC. Các tế bào này biểu hiện rất thấp dưới 2% các marker CD34, CD45 và HLA-DR, đây là các marker rất phổ biến được sử dụng để tham khảo và loại trừ để xác định tế bào gốc trung mô. Tế bào khảo sát đáp ứng được tổ hợp các marker cần khảo sát theo tiêu chuẩn của ISCT. Thứ ba, chúng tôi đã khảo sát sự biểu hiện của các marker dùng để xác định cho quần thể MSC từ mô mỡ, phương pháp phân tích dựa trên kỹ thuật đếm tế bào bằng phương pháp dòng chảy (Flow Cytometry) được thực hiện tại hai phịng thí nghiệm độc lập. Kết quả cho thấy tế bào dương tính khá cao (trên 95%) với các marker được CD73, CD90 và CD105. Đây là ba marker phổ biến được chấp thuận để xác định cho các MSC. Các tế bào này biểu hiện rất thấp dưới 2% các marker CD34, CD45 và HLA-DR, đây là các marker rất phổ biến được sử dụng để tham khảo và loại trừ để xác định tế bào gốc trung mô. Tế bào khảo sát đáp ứng được tổ hợp các marker cần khảo sát theo tiêu chuẩn của ISCT.
Như vậy, với kết quả khảo sát khả năng bám dính, tiềm năng biệt hóa và sự biểu hiện các marker bề mặt cho thấy quần thể tế bào ni cấy chính là các tế bào gốc trung mô. Đây là nguồn tế bào gốc rất quan trọng và đầy tiềm năng cho các ứng dụng cơ bản cũng như trên lâm sàng.
Các tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ hồn tồn cảm ứng biệt hóa được thành 3 dịng tế bào cơ bản của các tế bào có nguồn gốc từ trung mơ, thỏa tiêu chí của ISCT đưa ra.