C, 5% CO2 Môi trường được thay mới 2 ngày một lần.
TẠO KHUNG G-A VÀ KHUNG FIBRIN
2.2.2. Tạo khung nâng đỡ Fibrin Cơ sở khoa học:
Cơ sở khoa học:
Fibrin là sản phẩm cuối trong q trình đơng máu. Khi q trình đơng máu diễn ra, những phân tử fibrinogen (tiền thân của fibrin) được biến đổi nhờ enzyme thrombin với sự tham gia của ion Ca2+.
Phương pháp tiến hành:
Máu ngoại vi của người được thu nhận tại bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình TP.HCM và có các xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và VDRL. Máu được thu từ người tình nguyện và được chứa trong tube lấy máu có chất chống đơng Natri citrate 3.8%.
34
Hai thành phần cấu tạo của khung fibrin được thiết kết theo các quy trình sau: - Quy trình thu nhận thành phần fibrinogen (theo Hartman, 1992) [27]):
+ Máu có chứa chất chống đơng Natri citrate 3.8 % từ phịng xét nghiệm được đưa về phịng thí nghiệm và đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 05 phút, thu phần huyết tương.
+ Phần huyết tương thu được được đem đơng lạnh ở -200C trong 1 giờ sau đó để qua đêm ở 40C.
+ Sau đó, đem ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, chừa lại 0.5 ml và huyền phù phần cặn lắng.
+ Huyết tương này được sử dụng như là nguồn fibrinogen và được bảo quản trong tuýp ở -200
C.
+ Toàn bộ quá trình được tiến hành trong điều kiện vơ trùng.
- Quy trình thu nhận thành phần thrombin (theo Quick, 1996) [56]):
+ Máu ngoại vi có chứa chất chống đông Natricitrate 3.8 % được đem đi ly tâm 3000 vòng/phút trong 05 phút, thu phần huyết tương. Phần huyết tương thu được được đem đi bảo quản ở -200C, sử dụng trong vòng 1 tháng.
+ Lấy 02 ml huyết tương đông lạnh đem đi rã đơng và pha lỗng khoảng 5 lần với nước cất tạo thành dung dịch.
+ Bổ sung acid acetic 1% (để tạo pH 5.3). Lắc đều, sau đó để yên nhằm tạo kết tủa trong vòng 30 phút.
+ Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Thu tủa lắng, thêm dung dịch PBS vào để tạo thành 02 ml dung dịch và điều chỉnh pH về 7.0 (sử dụng dung dịch Na2CO3 0.01M).
+ Đem đi ủ ở nhiệt độ 370C trong thời gian 15 phút. Sau đó, bổ sung 0.1 ml CaCl2 0.1M. Xuất hiện khối đơng hơi đục trong vịng 1-2 phút.
+ Để thu nhận được dung dịch thrombin trong suốt, dùng đũa thủy tinh khuấy tròn để cuộn phần tủa đục vào đầu đũa.
+ Dung dịch thrombin này được bảo quản ở -200C sử dụng trong vịng 1 tháng. Quy trình tạo khung fibrin: fibrinogen và thrombin sau khi được thu nhận thành hai thành phần riêng biệt được trộn chung với nhau theo tỉ lệ 1:1 (v/v), để yên trong khoảng thời gian từ 1-5 phút ở nhiệt độ phòng sẽ tạo thành khung fibrin.
35
Các phương pháp đánh giá khung fibrin:
- Đánh giá cấu trúc:
Khung fibrin sau khi được tạo thành sẽ đi nhuộm mô học H&E để đánh giá cấu trúc bên trong cũng như sử dụng SEM để đánh giá bề mặt keo.
Khung fibrin phải có cấu trúc sợi, lỗ xốp liên thông được với nhau - Đánh giá độ an toàn sinh học:
Khung fibrin tạo ra phải vô khuẩn: sản phẩm keo cuối cùng phải đảm bảo vô khuẩn theo tiêu chuẩn giới hạn nhiễm khuẩn, phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam IV (2009). Đây là phương pháp nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong sản phẩm. Thử nghiệm này sẽ được thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Dược phẩm (thuộc Sở Y Tế TP.HCM).
Khung fibrin phải đạt độ vơ khuẩn theo tiêu chí của kỹ thuật đánh giá - Đánh giá độc tính thứ cấp trong điều kiện nghiên cứu in vitro
Khung fibrin được sử dụng làm giá thể để nuôi các nguyên bào sợi trong khoảng thời gian từ 0 – 48 giờ, theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 (Tests for Cytotoxicity—In Vitro
Methods).
Kết quả nuôi cấy nguyên bào sợi trên bề mặt khung fibrin sẽ được theo dõi trực tiếp dưới kính hiển vi đảo ngược và được ghi nhận, đánh giá lại bằng hình ảnh tế bào trên bề mặt khung.
2.3. NỘI DUNG 3: