C, 5% CO2 Môi trường được thay mới 2 ngày một lần.
TẠO KHUNG G-A VÀ KHUNG FIBRIN
CÁC CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ KHUNG G-A
2.2.1.1. Phương pháp đánh giá cấu trúc khung G-A
Cấu trúc lỗ xốp của khung G-A được đánh giá dựa vào kết quả nhuộm H&E và ảnh chụp SEM.
Thành phần nhóm chức của khung G-A được đánh giá dựa vào phổ hồng ngoại FTIR.
2.2.1.2. Phương pháp xác định độ hút nước của khung G-A
Cơ sở khoa học
Độ hút nước của khung nâng đỡ phụ thuộc vào tính chất của các thành phần cũng như độ xốp của khung nâng đỡ. Độ hấp thu nước được xác định dựa vào sự tăng khối lượng của khung nâng đỡ khô sau khi ngâm trong nước.
Phương pháp tiến hành
Khung G-A được cân để xác định khối lượng ban đầu (W0). Sau đó, mẫu được ngâm trong nước cất, ủ trong điều kiện 37oC và được cân lại sau các khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50, 60 phút (Wt). Trước khi cân, mẫu được thấm lượng nước thừa trên giấy lọc.
Khối lượng nước đã thấm vào bên trong mẫu được xác định dựa trên khối lượng tăng lên của mẫu. Từ đó, độ hút nước của khung G-A được tính theo cơng thức sau, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Cơng thức tính độ hút nước:
30
2.2.1.3. Phương pháp đánh giá độ phân huỷ in vitro của khung G-A
Cơ sở khoa học
Trong cơ thể tồn tại collagenase, đặc biệt collagenase tập trung nhiều tại các vị trí có vết thương (khoảng 2UI/ml). Collagenase có khả năng phân hủy gelatin. Do đó collagenase được sử dụng làm enzyme đánh giá sự phân hủy khung G-A in vitro.
Phương pháp tiến hành
Cân khối lượng khô (W0) của các mẫu GA. Sau đó, mẫu được ngâm trong lọ chứa 5ml colagenase 2U/ml, ủ mẫu ở điều kiện 37°C, tránh sáng. Sau các mốc thời gian 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 120 giờ, 168 giờ, lấy mẫu ra khỏi dung dịch, sấy khô và cân lại khối lượng (Wt). Khối lượng đã bị phân huỷ được đánh giá dựa trên phần trăm khối lượng còn lại sau phân huỷ (%) ở các mốc thời gian và được tính theo cơng thức:
Mức độ phân hủy (%) = 100 x (Wt – W0)/W0 (2)
Chỉ tiêu đánh giá
Độ phân hủy của các khối GA ở cả ba tỉ lệ được đánh giá thơng qua phần trăm khối lượng cịn lại của các khối GA qua các mốc thời gian.
2.2.1.4. Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của khung G-A bằng thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp
Cơ sở khoa học
Thử nghiệm độc tính nhằm kiểm tra khả năng gây độc của khung nâng đỡ với tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009. Đánh giá được thực hiện bằng thử nghiệm độc tính trực tiếp nhằm kiểm tra tác động của khung nâng đỡ khi tiếp xúc trực tiếp với tế bào. Độc tính của mẫu vật liệu được đánh giá qua quan sát sự thay đổi hình dạng của tế bào và tỉ lệ tế bào sống.
Phương pháp tiến hành
Các nguyên bào sợi người được cấy vào đĩa 4 giếng với mật độ 3x104/giếng và được nuôi ổn định trong 24 giờ. Tiếp theo, khung G-A được đặt trực tiếp trên bề mặt tế bào trong giếng, ủ ở điều kiện 37°C, 5% CO2. Sau 24 giờ, lấy khung G-A ra, tiến hành nhuộm Giemsa, quan sát và đánh giá hình dạng tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009. Mẫu đối chứng là giếng tế bào không được đặt khung G-A.
Chỉ tiêu đánh giá
- Về hình thái tế bào, đánh giá sự tác động của các khung G-A lên tế bào thông qua tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009 dựa trên bảng 2.1 cho thử nghiệm độc tính tiếp xúc trực tiếp.
31
Bảng 2.2. Các mức độ phản ứng cho thử nghiệm độc tính tiếp xúc trực tiếp
Chỉ số Mức độ phản ứng Mô tả
0 Không Không nhận biết có vùng tế bào chết xung quanh hoặc bên dưới vật liệu
1 Rất nhẹ Một vài tế bào chết hay thay đổi hình dạng bên dưới vật liệu 2 Nhẹ Vùng tế bào chết giới hạn ở khu vực bên dưới vật liệu 3 Trung bình Vùng tế bào chết lan ra xung quanh vật liệu từ 0,5 – 1 cm 4 Nặng Vùng tế bào chết lan ra xung quanh vật liệu trên 1 cm
* Vật liệu có các chỉ số từ 0-2 được xem là không độc
2.2.1.5. Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của khung G-A bằng thử nghiệm dịch chiết
Cơ sở khoa học
Thử nghiệm độc tính nhằm kiểm tra khả năng gây độc của khung nâng đỡ với tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009. Đánh giá được thực hiện bằng thử nghiệm độc tính dịch chiết nhằm kiểm tra tác động của các chất được khung nâng đỡ tiết ra trong môi trường nuôi cấy đối với tế bào. Độc tính của mẫu vật liệu được đánh giá qua quan sát sự thay đổi hình dạng của tế bào và tỉ lệ tế bào sống.
Phương pháp tiến hành
Dịch chiết được thu nhận bằng cách ngâm khung G-A trong môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 1ml mơi trường/1,25cm2
diện tích bề mặt khung G-A (ISO 10993- 5:2009) trong 24 giờ ở 37°C, 5% CO2. Các nguyên bào sợi người được cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 5x103 tế bào/giếng và được ni ổn định trong 24 giờ. Sau đó, mơi trường ni tế bào được thay bằng dịch chiết khung G-A và ủ trong 24 giờ ở điều kiện 37°C, 5% CO2. Sau 24 giờ, hút bỏ dịch chiết, nhuộm Giemsa và đánh giá hình thái tế bào (ISO 10993-5:2009). Mẫu đối chứng là giếng tế bào ni cấy trong mơi trường bình thường.
Chỉ tiêu đánh giá
Về hình thái tế bào, đánh giá sự tác động của các khung G-A lên tế bào thông qua tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009 dựa trên bảng 2.2 cho thử nghiệm độc tính dịch chiết.
32
Bảng 2.3. Các mức độ phản ứng cho thử nghiệm độc tính dịch chiết
Chỉ số Mức độ phản ứng
Mô tả
0 Không Các hạt trong bào tương riêng rẽ; khơng có sự ly giải tế bào 1 Rất nhẹ
Không quá 20% tế bào dưới dạng trịn, bám dính lỏng lẻo và khơng có hạt trong bào tương; thỉnh thoảng xuất hiện các tế bào ly giải
2 Nhẹ
Không quá 50% tế bào dưới dạng trịn, và khơng có hạt trong bào tương; Khơng có sự li giải tế bào lan rộng và vùng trống giữa các tế bào
3 Trung bình Khơng q 70% lớp đơn té bào chứa tế bào dạng tròn hoặc bị ly giải
4 Nặng Lớp đơn tế bào gần như bị phá huỷ hoàn toàn
* Vật liệu có các chỉ số từ 0-2 được xem là khơng độc
2.2.1.6. Phương pháp đánh giá tính tương hợp sinh học in vivo của khung G-A
Cơ sở khoa học
Cơ thể sẽ phản ứng lại với các vật lạ khi được ghép vào bằng các đáp ứng khác nhau tùy vào sự tương hợp sinh học giữa vật liệu ghép và cơ thể chuột. Khung G-A được ghép vào vùng dưới da lưng chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino qua quy trình tiểu phẫu để trong khoảng thời gian vài ngày đến vài tháng nhằm đánh giá đáp ứng của cơ thể chuột lên khung nâng đỡ. Trong thành phần máu, số lượng các bạch cầu thay đổi rất ít trong điều kiện bình thường. Sự thay đổi số lượng bạch cầu sẽ là một trong những dấu hiệu cho ta biết được trạng thái sinh lý của cơ thể. Vì vậy, số lượng bạch cầu là một chỉ tiêu đánh giá đáp ứng của cơ thể đối với vật liệu cấy ghép. Hơn nữa, các tế bào miễn dịch và các tế bào mô liên kết sẽ xâm nhập vào cấu trúc vật ghép. Việc tiến hành nhuộm mô học giúp xác định sự xâm nhập của các tế bào này vào vật liệu ghép và sự tồn tại của vật liệu bên trong cơ thể chuột.
Phương pháp tiến hành
Phương pháp ghép khung nâng đỡ vào dưới da lưng chuột
Chuột sẽ được tiêm thuốc mê vào bắp đùi với liều 0,1ml/25g. Sau khi chuột hôn mê, tiến hành cố định chuột trên khay inox bằng băng dính. Cạo sạch lơng vùng thao tác và sát trùng bằng Povidine. Rạch một đường khoảng 1cm ở vị trí giữa da lưng chuột, từ vết mổ mở rộng phần không gian dưới da lưng chuột về hai bên. Ghép hai khung G-A vào hai bên lưng chuột. Sau đó, khâu kín vết thương và sát trùng lại bằng Povidine.
33
Phương pháp đánh giá sự xâm nhập tế bào vào trong khung G-A
Sau các mốc thời gian 4, 7, 14, 28, 56 ngày, khung G-A sẽ được lấy ra quan sát. Cố định mẫu với dung dịch Fomalin 10%, bảo quản ở điều kiện 4°C trước khi tiến hành phương pháp nhuộm H&E để đánh giá mô học.
Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng của chuột
Máu ở tĩnh mạch đuôi chuột được hút vào ống trộn bạch cầu tới vạch 0.5 rồi hút tiếp dung dịch ly giải hồng cầu đến vạch 11, như vậy, bạch cầu được pha loãng 20 lần. Lắc 3 lần, để yên trong 3 phút để hồng cầu ly giải hoàn toàn. Chuẩn bị lamelle khô và đặt trên buồng đếm hồng cầu, bỏ 2 – 3 giọt huyền phù tế bào trước khi cho vào 2 buồng đếm, chờ 1 phút để tế bào lắng xuống và đặt lên kính hiển vi để đếm số lượng tế bào bạch cầu trong 4 ơ vng lớn ở 4 góc (vùng 16 ơ), diện tích mỗi ơ lớn là 1mm2. Các bạch cầu được xác định có nhân, màng, kích thước tương đối lớn. Mỗi mẫu máu được đếm 3 lần. Nếu gọi A là số bạch cầu đếm được trên 64 ơ trung bình (4 mm2) thì số bạch cầu trong 1mm3 sẽ là :
Số bạch cầu trong 1mm3 = ( Ax10x20)/4 = Ax50 (4)
Chỉ tiêu đánh giá
Sự tồn tại của khung G-A qua các mốc thời gian khảo sát.
Sự tăng giảm số lượng bạch cầu tổng của chuột ghép khung G-A qua các mốc thời gian khảo sát.
Sự xâm nhập của các tế bào miễn dịch và tế bào mô liên kết.