C, 5% CO2 Vì khung G-A có cấu trúc lỗ xốp nên các tế bào sau khi được chuyển lên khung và nuôi trong mơi trường phù hợp sẽ di cư, bám dính và
3. Định nghĩa và một số thuật ngữ FB: Fibrinogen
FB: Fibrinogen
rpm: rotations per minute
4. Nguyên tắc
Khung fibrin được tạo thành từ sự kết hợp của FB và thrombin theo một tỉ lệ thể tích phù hợp. Do đó, để có được khung fibrin phải thu nhận được FB và thrombin.
FB được thu nhận từ máu ngoại vi của người theo phương pháp tủa lạnh [1,2,4,5]. Máu sau khi thu nhận sẽ được để lắng ở 40C trong khoảng thời gian từ 3 - 4 giờ. Sau đó, tiếp tục đem ủ qua đêm ở -200C. Tiếp tục rã đông và quay ly tâm để thu phần cặn lắng, hòa phần cặn lắng với nước cất. Đây chính là dung dịch fibrinogen
Thrombin được thu nhận dựa trên nghiên cứu của tác giả Saxena S. và cộng sự [3] và các tác giả khác [1,2,4,5]. Đây là phương pháp thu nhận thrombin dựa trên nguyên tắc tủa lạnh và có bổ sung một số chất hóa học để tủa lượng thrombin có trong phần huyết tương của máu ngoại vi.
3
5. Biện pháp phịng ngừa an tồn
Xử lý tất cả các thành phần của máu và dịch xem như là những vật liệu truyền nhiễm bệnh. Mang găng sạch và găng vơ trùng trong q trình vận chuyển và thao tác xử lý mẫu.
6. Thiết bị và vật liệu
6.1. Thiết bị
Tủ lạnh Sanyo SR 4170
Máy quay ly tâm lạnh, Universal 320R, Hettich Tủ ủ ấm CO2, Heraeus
Tủ -200C, Sanyo Máy đo pH
6.2. Vật liệu
Tube quay ly tâm 15 ml, 50 ml (Corning) Pasteur pipette (Wheaton)
Găng sạch (MERUFA) Găng vô trùng (MERUFA) Bơm tiêm (Vinahankook) Đĩa petri Màng lọc 0.2um Becher 50, 100, 250ml Ependorff Đầu type 1000 µl Đầu type 100µl
Pipetman 10 - 1000µL (Gilson, The Netherlands)
6.3. Hóa chất
4 Acetic acid (glacial) 100% (1.00063.1000, Merck KGaA)
Na2CO3 (A756492 628, Merck KGaA)
NaCl (K43831304 236, Merck KGaA)
Ethanol (Merck)
Nước cất
7. Mẫu nghiên cứu
7.1. Thu nhận mẫu
Máu ngoại vi được thu nhận trong tube có chứa natri citrate để chống đơng máu.
7.2. Quy trình thu nhận mẫu
Mẫu máu ngoại vi được thu nhận trong phòng sạch, bằng bơm tiêm vô trùng. Mẫu được cho ngay vào tử 40C để chờ xử lý.
8. Quy trình thực hiện
8.1. Quy trình thu nhận fibrinogen
Máu thu nhận được để yên ở 40
C nhằm để phân tách các thành phần của máu.
Sau khoảng thời gian 3-4 giờ đem quay ly tâm ở 3000 rpm trong 15 phút. Thu nhận phần huyết thanh.
Phần huyết thanh thu được, được đem đông lạnh ở -200C qua đêm.
Phần dịch này chính là dịch FB và được bảo quản trong tube bảo quản lạnh ở điều kiện -200C sử dụng trong vòng 1 tháng.
Tồn bộ q trình được tiến hành trong điều kiện vơ trùng.
8.2. Quy trình thu nhận thrombin
Máu thu nhận được để yên ở 40
C nhằm để phân tách các thành phần của máu. Sau khoảng thời gian 3-4 giờ đem quay ly tâm ở 3000 rpm trong 15
5
phút. Thu nhận khoảng 1ml huyết tương cho vào tube bảo quản qua đêm ở - 200C.
Lấy 1 ml huyết tương đông lạnh đem đi rã đơng ở 2 - 4℃ và pha lỗng với nước cất tạo thành 10 ml dung dịch.
Thêm dung dịch acid acetic 1% (tạo pH 5.3). Lắc đều sau đó để yên để tạo kết tủa trong vòng 30 phút. Ly tâm 3000 rpm trong 5 phút. Thu tủa lắng, thêm dung dịch DPBS vào và điều chỉnh pH 7.0 (sử dụng dung dịch Na2CO3 0,01M).
Đặt dung dịch trong mơi trường có nhiệt độ 370C trong 15 phút sau đó bổ sung CaCl2 0,1M. Xuất hiện khối đơng hơi đục trong vịng 1-2 phút.
Để thu nhận được dung dịch thrombin trong suốt, dùng đũa thủy tinh khuấy tròn để cuộn phần tủa đục vào đầu đũa, phần còn lại là thrombin. Cho vào type tube eppendorf.
Dung dịch thrombin này được bảo quản ở -200C sử dụng trong vòng 1 tháng.
Tồn bộ q trình được tiến hành trong điều kiện vô trùng.
9. Đánh giá kết quả
Quy trình trên có tỉ lệ thành cơng trên 90%, các chỉ tiêu cần đánh giá:
Dịch fibrinogen thu được có màu vàng sáng. Định lượng nồng độ FB theo phương pháp đo trực tiếp.
Dịch thrombin thu được trong suốt, không màu.
Khung fibrin được tạo thành bằng cách cho kết hợp với tỉ lệ 1:1 (v/v) giữa fibrinogen và thrombin.
10. Tài liệu tham khảo
1. Frederick H. Silver, Ming-Che Wang, George D. Pins (1995). Preparation and use of fibrin glue in surgery. Biomaterials, 16:891-903.
6 2. Moon Suh, Choong Ik Cha (1993). Biochemical aspects of autologous fibrin glue
derived from ammonium sulfate precipitation. Laryngoscope, 103:193-196.
3. Saxena S, Jain P, Shukla J (2003). Preparation of two component Fibrin Glue and its clinical evaluation in skin grafts and flap. Indian Journal Plastic Surgery, 36,14-17
4. Vera Van Velthoven, Georg Clarici, Ludwig M Auer (1991). Fibrin tissue adhesive sealant for the prevention of CSF leakage following transsphenoidal microsurgery.
Acta Neurochir, 109:26-29.
5. Weisel JW and Nagaswami C (1992). Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal, 63(1): 111–128.
1