C, 5% CO2 Vì khung G-A có cấu trúc lỗ xốp nên các tế bào sau khi được chuyển lên khung và nuôi trong mơi trường phù hợp sẽ di cư, bám dính và
PHỤ LỤC SẢN PHẨM
I TƯỢNG ‐ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sỏi được tán với Holmium: YAG LASER 200micron: SPHINX 30, tán nát sỏi hồn tồn. Sau đó bơm rửa sỏi với quan sát máy soi và C‐ Arm. Cuối cùng đánh giá tỉ lệ sạch sỏi dưới C‐ Arm và siêu âm. Rút kim và đặt thơng mono‐ J vào bể thận.
Đối tượng nghiên cứu
Mơ mỡ người được thu nhận từ việc chọc hút mỡ hoặc các mơ mỡ thừa được thu nhận từ các quy trình phẫu thuật. Mẫu mơ được thu nhận từ các người hiến khỏe mạnh, đồng ý hiến mơ để tiến hành nghiên cứu và có các xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và VDRL.
Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện là phương pháp thực nghiệm mơ tả
Thu nhận mơ mỡ
Mẫu mơ được thu nhận trong điều kiện vơ trùng của phịng mổ. Sau đó giữ mẫu trong mơi trường vận chuyển gồm: Mơi trường DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml) và nhanh chóng chuyển về phịng thí nghiệm.
Phân lập và ni cấy tế bào gốc từ mơ mỡ
Mơ mỡ được đặt trong đĩa petri sạch và rửa với dung dịch PBS có chứa penicillin /Streptomycin. Bổ sung mơi trường ni cơ bản (mơi trường DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D‐Panto (17
μm), penicillin (100U/ml) and streptomycin (0.1 mg/ml)) vào đĩa, loại bỏ phần mơ liên kết thừa và rửa sạch máu.
Cắt nhỏ mẫu mơ và chuyển tất cả vào tube 50 ml có nắp đậy, bổ sung hỗn hợp enzyme Dispase‐Collagenase (với tỉ lệ 3:1, v/v), mẫu mơ được ủ ở nhiệt độ 370C, trong thời gian 90 phút. Sau đó, ly tâm thu nhận phần cặn lắng ở
đáy chai. Bổ sung mơi trường ni cơ bản vào
tube và huyền phù phần cặn lắng ở đáy chai. Lọc phần dịch tế bào qua phễu lọc tế bào (cell
strainer, BD FalconTM) với đường kính 70 μM. Quay li tâm phần dịch tế bào và thu phần cặn lắng ở đáy chai. Sau đó, bổ sung dung dịch ly giải hồng cầu để loại bỏ hồng cịn lẫn tạp trong dịch tế bào, để n trong khoảng 10 phút
để loại bỏ hồng cầu. Sau đó, quay li tâm phần dịch tế bào và thu phần cặn lắng ở đáy chai. Bổ sung mơi trường ni cơ bản và huyền phù phần cặn lắng, đánh giá mật độ tế bào bằng cách nhuộm với dung dịch Trypan blue và
đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer. Tế bào được ni trong chai ni T‐25 cm2 và ở nhiệt
độ 370C và 5% CO2.
Định danh tế bào gốc trung mơ
Theo tổ chức The International Society for Cellular Therapy đưa ra các ngun tắc chung
để xác định một loại tế bào gốc là MSC cần phải thỏa 3 điều kiện sau: thứ nhất, các MSC phải là các tế bào có khả năng bám dính khi tiến hành ni cấy trên bề mặt chai ni. Thứ hai, phải có khả năng biệt hóa thành ngun bào xương, tế bào mỡ hoặc tế bào sụn trong
điều kiện in vitro. Thứ ba, các tế bào này phải biểu hiện được các marker bề mặt như CD105, CD73 và CD90, khơng biểu hiện các marker như CD45, CD34, CD14 và HLA‐DR(2). Dựa theo các tiêu chuẩn trên, chúng tơi đánh giá các tế bào bào ni cấy từ mơ mỡ là các MSC.
Để đánh giá khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt chai ni. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi đảo ngược và nhuộm tế bào
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật – Bệnh Viện Chợ Rẫy ‐ Năm 2013 136
bằng thuốc nhuộm Giemsa để quan sát hình thái và khả năng bám dính của tế bào.
Để khảo sát tiềm năng biệt hóa của tế bào, tiến hành thu nhận tế bào kể từ sau lần cấy chuyền thứ hai. Các tế bào này sẽ được thử nghiệm để cảm ứng biệt hóa thành ngun bào xương và tế bào mỡ.
Quy trình biệt hóa thành nguyên bào xương từ các tế bào gốc mô mỡ như sau: tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai được chuyển lên một chai nuôi mới và sau một ngày nuôi cấy
được thay bằng môi trường cảm ứng tạo ngun bào xương gồm DMEM/F12, 10% FBS, 10‐7M Dexamethasone, 10mM/ml β‐Glycerol
phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml FGF9, 10‐7M vitamin D2 và kháng sinh(8).
Kết quả sau 14 ngày ni cấy sẽ được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá sự thay đổi về mặt hình thái. Tiến hành nhuộm Alizarin Red (AR), Von Kossa (VK) để
đánh giá khả năng tạo chất nền xương và Alkaline phosphatase (AP) để đánh giá hoạt tính enzyme đặc trưng cho tế bào xương. Ngồi ra, thực hiện phản ứng RT‐PCR để khảo sát sự biểu hiện gien Osteocalcin (là một trong những gien hiện tại được sử dụng để xác định cho tế bào xương).
Quy trình biệt hóa thành tế bào mỡ từ các tế bào gốc mơ mỡ như sau: tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai được chuyển lên một chai ni mới và sau một ngày ni cấy được thay bằng mơi trường cảm ứng tạo tế bào mỡ gồm DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D‐Panto (17 μm), Human insulin (66 nM), Triiodo‐L‐thyronine (1nM), Human transferrin (10μg/ml)(9).
Kết quả sau 14 ngày ni cấy sẽ được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá sự thay đổi về mặt hình thái. Tiến hành nhuộm Oil Red O để đánh giá sự tích tựu các giọt lipid bên trong tế bào và nhuộm hóa mơ miễn dịch huỳnh quang Nile Red (là một trong các phương pháp nhuộm đặc hiệu hiện tại
được sử dụng để xác định cho tế bào mỡ).