Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.4. Phương pháp nhân gen bằng RT-PCR và Nested PCR
• RT-PCR: Genom virút sởi và Rubella đều là một chuỗi ARN đơn. Phản ứng RT-PCR gồm hai giai đoạn chính là phiên mã ARN virút thành ADNc nhờ enzym phiên mã ngược và tổng hợp ADN dưới tác dụng của DNA polymerase. Đoạn ADN nucleoprotein N đặc hiệu virút sởi và glycoprotein E1 đặc hiệu virút Rubella được tổng hợp, sử dụng Kit Superscript One-step RT-PCR với enzym platinum Taq polymerase (Invitrogen). Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành theo thường quy chuẩn của phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử, Trung tâm Bệnh viện Trường Đại học (Caen, Pháp).
Trình tự cặp mồi cho RT-PCR khuếch đại đoạn ADN 587 bp đặc hiệu virút sởi: - mồi xuôi (n1): 5’GCT ATG CCA TGG GAG TAG GA 3’,
- mồi ngược (n2R): 5’ GGC CTC TCG CAC CTA GTC TA 3’.
Trình tự cặp mồi cho RT-PCR khuếch đại đoạn ADN 380 bp đặc hiệu Rubella: - mồi xuôi (Ru 1TR) : 5’ CGT ATG TGG AGT CCG CAC TT 3’,
- mồi ngược (Rube 1F): 5’ CGT CTG GCA ACT CTC CGT 3’.
RT-PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl dung dịch: 2,5µl mẫu ARN virút sởi/Rubella; 6,5µl H2O; 12,5µl đệm 2X Invitrogen; 1,5µl mồi xuôi 10µM; 1,5µl mồi ngược 10µM; 0,5µl enzyme superscript II RT / Platinum Taq Invitrogen 5U/µl. Chu kỳ
phản ứng RT-PCR: 55°C/30’; 94°C/4’; [95°C/30’’, 57°C/30”, 72°/1’] x10; [95°C/30”, 57°C/30”, 72°C/1’] + 5’’/chu kỳ x 25; 72°C/10’; 4°C/∞. Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm edithium brommit.
• Nested PCR: Với các chủng virút không xác định được băng ADN sau RT- PCR, cần tiến hành tiếp phản ứng Nested PCR. Phản ứng Nested PCR làm tăng độ
nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng PCR thứ nhất bằng cách nhân lên đoạn ADN bên trong vùng khuếch đại. Với các cặp mồi chọn lựa, đoạn ADN gen N virút sởi có kích thước khoảng 492-576 bp bên trong vùng khuếch đại đươc nhân lên. Trình tự cặp mồi cho phản ứng Nested PCR: mồi xuôi (n3): 5' CCA TGG GAG TAG GAG TGG 3', mồi ngược (n4R):5' CTC TCG CAC CTA GTC TAG 3'.
Phản ứng Nested PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µl dung dịch mẫu:5µl mẫu ADN virút sởi; 11,6µl H2O; 2,5µl đệm 2X Invitrogen; 2,5µl dNTP 2mM; 0,75 µl
MgCl2 50 mM; 1,25µl mồi xuôi 10µM; 1,25µl mồi ngược 10µM; 0,15µl platinum Taq polymerase Invitrogen 5U/µl. Chu kỳ phản ứng Nested-PCR: 95°C/3’; [95°C/30’’; 57°C/30’’; 72°C/1’] x10; [95°C/30’’; 57°C/30’’; 72°C/1’] + 5’’/chu kỳ x 25; 72°C/10’.
Sản phẩm thu được sau Nested PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm với edithium brommit.
2.2.1.5. Phương pháp RFLP
RFLP là tên gọi tắt của phương pháp Đa hình chiều dài các đoạn cắt enzym hạn chế (Restriction enzym). Phương pháp RFLP cho khả năng phát hiện các thay đổi cấu trúc ADN qua các hình vạch trên bản gel điện di. Enzym cắt hạn chế là những endonucleaza do vi khuẩn sinh ra và có khả năng nhận biết những vị trí cắt hạn chếđể
cắt chuỗi ADN dài thành những phân đoạn có chiều dài khác nhau. Nếu chọn được tổ
hợp ADN/ loại enzym hạn chế, có thể thiết lập được “vân tay” (Fingerprint) đặc trưng cho cá thể có chứa loại phân tử ADN. Những thay đổi trên ADN có thể nhận biết bằng sự có mặt hoặc biến mất các vị trí cắt của enzym hạn chế. Những sự khác nhau khi so sánh mẫu cắt hạn chế ADN toàn phần được sử dụng đểđánh giá tính đa dạng di truyền. Quy trình kỹ thuật RFLP được hoàn chỉnh và ứng dụng để phân tích đoạn gen N genotyp chủng virút sởi. Đoạn gen ADN này có khoảng 550-563 bp do vậy cần phải chọn các enzym hạn chế có khả năng cắt được 2-3 lần để tạo ra các hình có từ 3-4 vạch. Dựa trên chương trình tin học NEBcutter (New England Biolabs, Mỹ) các enzym
HaeIII, MboI và ScrFI đã được chọn lựa để phân tích genotyp chủng virút sởi. Dựa trên sự biến đổi của các ví trí cắt hạn chế trên trình tự ADN gen N tính đa dạng của genotyp virút sởi được phân tích. RFLP được tiến hành với tổng thể tích 20 µl mẫu: 7µl mẫu ADN, 1µl enzym cắt hạn chế, 2µl đệm 10X, 10µl H20. Ủở nhiệt độ 37°C trong 1-3 giờ. Sản phẩm RFLP kiểm tra trên gel agarose 3% nhuộm với edithium brommit.
2.2.1.6. Phương pháp multiplex realtime PCR
+ Phương pháp multiplex PCR
Virút sởi và Rubella gây sốt phát ban ở người với bệnh cảnh lâm sàng khó phân biệt. Phương pháp multiplex PCR đã được áp dụng nhằm chẩn đoán phân biệt căn nguyên gây bệnh. Các cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại đoạn ADN gen N virút sởi và gen E1 virút Rubella được trộn chung với cùng một mẫu xét nghiệm và các thành phần
tham gia phản ứng. Trình tự cặp mồi nhân đoạn ADN gen N virút sởi và đoạn ADN gen E1 virút Rubella cho phản ứng được thiết kế như sau:
Trình tự cặp mồi nhân đoạn ADN gen N virút sởi:
- Mồi xuôi (Sar 1F): 5’ CGG AGC TAA GAA GGT GGA TAA 3’ - Mồi ngược (Sar 1R): 5’ CTC CCA TGG CAT AGC TCC A 3’. Trình tự cặp mồi nhân đoạn ADN gen E1 virút Rubella:
- Mồi xuôi (Ru 1TR): 5’ CGT ATG TGG AGT CCG CAC TT 3’ - Mồi ngược (Rube 1F): 5’ CGT CTG GCA ACT CTC CGT 3’.
Phản ứng RT-PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µl mẫu thành phần phản
ứng, sử dụng Kit Qiagen One-step RT-PCR. Trong đó, 2,5µl mẫu phân tích được trộn trong đệm phản ứng có chứa các thành phần: 5µl đệm 5X; 1µl dNTPm 10mM; 3µl Q solution 5X; 1,2µl mồi xuôi (Sar 1F) 10µM; 1,2µl mồi ngược (Sar 1R) 10 µM; 1,2µl mồi xuôi (Ru 1TR) 10µM; 1,2µl mồi ngược (Rube 1F) 10µM; 1µl Enzyme polymease 1unit/µl; 7,7 µl H20.
Chu kỳ phản ứng multiplex PCR: 50°C/30’; 94°C/15’; [94°C/30’’; 60°C /30’’ 72°C/1’] x 40; 72°C/10’. Sản phẩm thu được sau Nested PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm với edithium brommit. Các băng ADN với kích thước đặc hiệu của genom virút cho phép xác định sự có mặt của virút gây bệnh.
+ Phương pháp multiplex realtime PCR
Hình 2.2.1.6. Nguyên lý multiplex realtime PCR sử dụng Taqman probe
Quy trình multiplex PCR được cải tiến thêm để có thể định lượng ADN virút với sự hỗ trợ của máy realtime PCR. Sản phẩm khuếch đại lúc này không phải phát hiện ở bước cuối cùng mà
được phát hiện ở mỗi chu kỳ nhiệt bằng cách dùng máy realtime PCR đo tín hiệu huỳnh quang tức thời. Sản phẩm ADN khuếch đại được phát hiện bằng cặp mồi có gắn Taqman probe.
Multiplex realtime PCR được tiến hành trong một ống phản ứng với cặp mồi Sar 1F + Sar 1R cho khuếch đại ADN gen N virút sởi và Ru 1TR + Rube 1F cho ADN gen E1 Rubella cùng với toàn bộ các thành phần tham gia phản ứng.
Probe: RV323r: 5’JOE- GAT CAC CCA GCA CTC CAC GCAA –BHQ1 3’ MVTqrv: 5’FAM- TCT TGC TCG CAA AGG CGG TTA CGG- BHQ1 3’ Bằng multiplex realtime PCR cho kết quả chẩn đoán xác định đồng thời bệnh phẩm nhiễm sởi và Rubella.