Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotit
Phương pháp xác định trình tự nucleotit của ADN phổ biến nhất là phương pháp Sanger. Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp chuỗi ADN bổ sung cho trình tự chuỗi ADN cần xác định. Đây là phương pháp enzym học tiến hành tổng hợp các phân tử
ADN với một hàm lượng nhỏ dẫn xuất dideoxy của các nucleotit (ddNTP). Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của phương tiện kỹ thuật, việc xác định trình tự ADN được tiến hành tựđộng hoá bằng hệ thống máy giải trình tự. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có 1 vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch
điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ ánh sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ các đỉnh cường độ
ánh sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn ADN. Người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau
đểđánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tựđược thực hiện chỉ trong một
ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng.
Dựa trên nguyên lý chung của phương pháp sequencing, trình tự các đoạn ADN genom virút sởi và Rubella được xác định. Sản phẩm ADN virút sau phản ứng RT- PCR được tinh sạch theo phương pháp enzyme ExoSAP-IP của phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử CHU Caen (Pháp). Đoạn gen ADN sau tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 2%. Giải trình tự ADN gen N virút sởi được tiến hành với thể tích 1-2 µl mẫu ADN tinh sạch, sử dụng CEQ DTCS Quick start kit theo thường quy của Phòng thí nghiệm Chuẩn thức Quốc gia CNR Sởi Lyon (Pháp). Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng
cho phản ứng RT-PCR được sử dụng làm khuôn mẫu cho giải trình tự. Trình tự đoạn gen ADN 552 bp đặc hiệu virút sởi và 380 bp đặc hiệu Rubella được xác định. Trình tự
đoạn gen ADN được sử dụng làm cơ sở dữ liệu cho việc phân tích genotyp chủng virút.