Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2.1.4.Kết quả RFLP phân tích tính đa dạng đoạn ADN ge nN virút sởi + Chọn lựa enzym cắt hạn chế
+ Chọn lựa enzym cắt hạn chế
Phương pháp RFLP cho khả năng phân tích các thay đổi trình tự nucleotit qua các hình ảnh băng ADN sau khi cắt với enzym hạn chế. Những thay đổi trên ADN có thểđược nhận biết bằng sự có mặt hoặc biến mất các vị trí cắt của enzym. Để phân tích những thay đổi trình tự ADN cần phải chọn các enzym hạn chế có khả năng tạo ra
được sựđa dạng.
Theo thiết kế của các mồi đặc hiệu, chuỗi nucleotit gen N virút sởi thu được sau RT-PCR có chiều dài khoảng 550-587 bp, do vậy cần phải chọn các enzym hạn chế có khả năng cắt được 2-3 lần để tạo ra các hình có từ 3-4 vạch. Trong tổng số 268 enzym hạn chế (NEB, Mỹ), đã lựa chọn được 3 enzym phù hợp nhất cho nghiên cứu, đó là enzym Mbo I, Hae III và ScrF I. Sử dụng chương trình tin học NEBcutter (NEB, Mỹ) xác định rõ vị trí cắt hạn chế của Mbo I (↓↓GGAATTCC), Hae III (GG↓↓CC) và ScrF I (CC↓↓NGG ) phù hợp với trình tự đoạn ADN đặc hiệu virút sởi. Dựa trên sự biến đổi của các ví trí cắt trên trình tự ADN, tính đa dạng của genotyp virút sởi được phát hiện.
Trong thực nghiệm, đoạn ADN gen N virút sởi có kích thước 587 bp của 3 mẫu virút sởi đại diện được chọn lựa cho RFLP, cắt với Mbo I, Hae III và ScrF I. Các mẫu
được chọn để phân tích gồm: (i) chủng virút sởi hoang dã phân lập từ mẫu bệnh phẩm VN, (ii) mẫu vắcxin sởi EME732A/Bicken Cam (Osaka, Nhật Bản) và (iii) mẫu vắcxin sởi W6675/Rouvax-Aventis Pasteur (Pháp). Các mẫu ADN được cắt song song với cả
3 enzym kể trên để xác định kích thước các băng ADN tạo ra. Kết quả cho thấy sự
khác nhau về kích thước các hình vạch của các mẫu ADN trên bản điện di agarose 3%. Chương trình NEBcutter cho phép tính toán xác định vị trí cắt của các enzym hạn chế trên đoạn ADN virút sởi chuẩn. So sánh với tính toán lý thuyết nhận thấy chủng virút sởi VN (i) và chủng vắcxin sởi Nhật Bản (ii) có hình vạch tương tự
genotyp nhóm H, chủng vắcxin sởi Pháp (iii) có hình vạch tương tự genotyp nhóm A. Dựa trên kết quả thu nhận, enzym Mbo I được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
(a) (b)
Hình 3.2.1.4A. Kết quả RFLP cắt bởi enzym Mbo I (a) so sánh với tính toán lý thuyết (b)
1. Thang ADN chuẩn LMW (NEB) 2,3. Mẫu ADN virút sởi VN.
Kết quả điện di gel agarose 3% trên Hình 3.2.1.4Aa cho thấy, hai đoạn gen ADN từ 2 mẫu virút sởi VN cắt với Mbo I cho 5 băng ADN, ước lượng có kích thước khoảng 248, 155, 55+53, 40 và 25 bp. Tổng chiều dài đoạn ADN thu được sau RFLP khoảng 576 - 587 bp, khớp với kích thước của đoạn ADN gen N đặc hiệu virút sởi. Kích thước các băng ADN trên gel được so sánh với kích thước theo tính toán lý thuyết của chương trình NEBcutter (Hình 3.1.4.1Ab). Các kết quả thu nhận từ thực nghiệm chính xác và phù hợp với tính toán lý thuyết. Điểm mới của nghiên cứu là việc kết nối hiệu quả chương trình tin học NEBcutter trong việc chọn lựa các enzym cắt hạn chế
cho thực hiện RFLP, thay thế cho việc phải lựa chọn thủ công như trước đây. So sánh với một số chương trình tin học hiện đang được sử dụng cho việc tìm vị trí cắt của enzym cắt hạn chế như In silico, EnzymeX… chúng tôi nhận thấy chương trình NEBcutter là một công cụ hữu hiệu trong việc chọn lựa các enzym cắt hạn chế.
+ Kết quả RFLP phân tích genotyp chủng virút sởi lưu hành tại VN
Từ các kết quả đã thu nhận, enzym Mbo I được lựa chọn cho phân tích genotyp chủng virút sởi hoang dã lưu hành tại VN. Chủng sởi trong nghiên cứu được phân lập từ các vụ dịch bùng phát trong năm 2006-2008 tại một số địa phương miền Bắc VN. Kết quả RFLP phân tích tính đa dạng của virút sởi được thể hiện trên Hình 3.2.1.4B Các đường chạy 1, 2, 3, 4 trên bản gel biểu hiện hình ảnh của các băng ADN chủng
virút phân lập từ vụ dịch sởi tại Ninh Bình (2008). Trên đường chạy 5, 6, 7, 8, 9, 10 là chủng sởi Lai Châu, Thái Nguyên và Điện Biên (2006). Đường gel 11 là băng vạch mẫu ADN chủng vắcxin AIK-CVero.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hình 3.2.1.4B. Kết quả RFLP chủng virút sởi cắt với enzym Mbo I
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Mẫu ADN virút sởi VN .
11. Mẫu ADN vắcxin sởi AIK-Vero; 12. Thang ADN chuẩn LMW (NEB, Mỹ). Kết quảđiện di cho thấy, hình vạch các đoạn ADN chủng sởi chia thành 3 nhóm khác biệt do có sự biến đổi về vị trí cắt đặc hiệu của enzym Mbo I. So sánh với tính toán lý thuyết, genotyp chủng sởi lưu hành tại VN thuộc nhóm H, khác biệt với chủng vắcxin AIK-C Vero có hình vạch tương tự nhóm A.
Theo các công bố khoa học, phương pháp RFLP hiện được sử dụng rộng rãi cho phân tích genotyp chủng vi khuẩn lao. Trên thực tế, để phân tích những thay đổi ADN cần phải chọn các enzym hạn chế có khả năng tạo được các hình đa dạng cho những trường hợp cụ thể. So sánh kết quả thu nhận của chúng tôi với các tác giả khác cho thấy chưa hề có công bố về các kết quả nghiên cứu trùng hợp. Công trình nghiên cứu phân tích genotyp chủng virút gây bệnh bằng phương pháp RFLP của các tác giả trong nước hầu như rất ít [13], [22]. Kết quả thu nhận từ thực nghiệm của chúng tôi phù hợp với đánh giá chung về tính ưu việt của phương pháp RFLP. (i) Phương pháp RFLP không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền. (ii) Quy trình thực hiện nhanh và đơn giản, phản
ứng được ủ ở nhiệt độ ủ 37°C, trong thời gian từ 1-3 tiếng. (ii) Cho khả năng xét nghiệm số mẫu lớn, thích hợp trong việc sàng lọc và xác định sớm căn nguyên gây dịch. Điều này phù hợp trong giám sát dịch tễ học nhằm chẩn đoán sớm và ngăn chặn
kịp thời dịch bệnh bùng nổ. Những kết quả thu được của công trình này hy vọng sẽ mở
ra hướng nghiên cứu ứng dụng phương pháp “non sequencing” cho các nghiên cứu Dịch tễ học phân tử.
Điểm mới nổi bật trong công trình nghiên cứu của chúng tôi là đã hoàn thiện và
ứng dụng phương pháp RFLP trong phân tích genotyp virút sởi. Bằng phương pháp RFLP tính đa dạng của các genotyp virút sởi hoang dã lưu hành tại VN đã được phân tích. Hình ảnh băng ADN trên bản gel điện di sau RFLP là cơ sở dữ liệu cần thiết
cho việc xây dựng quy trình ứng dụng Tin sinh học trong nghiên cứu phân tích genotyp chủng virút sởi.