II. RT-PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN ADN GEN E1 VIRÚT RUBELLA
6. Chuẩn Rubella dương tính 8 Thang ADN chuẩn 100 bp
Ảnh điện di đồ trên Hình 3. cho thấy xuất hiện một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 380 bp, phù hợp với cặp mồi đặc hiệu.
Tài liệu tham khảo
10
Đoạn gen ADN virút sởi nhân lên sau phản ứng RT-PCR / Nested-PCR.
Vật liệu, sinh phẩm, hoá chất
• Mẫu ADN virút sởi 587 bp sau RT-PCR hoặc 576 bp sau Nested-PCR • Enzym cắt hạn chế: MboI, Hae III, ScrFI (New England Biolabs, Mỹ).
• Hoá chất, sinh phẩm: Agarose Low Melting Temperature (Sigma, Mỹ), Tris base, EDTA, Edithium Bromid…(Bio-Rad), Thang chuẩn LMW, 100 bp (New England Biolabs, Mỹ). • Máy ly tâm, micro centrifuge tube (Eppendorf, Đức).
• Máy điện di (Bio-Rad, Mỹ).
• Máy chụp ảnh gel doc (Hãng Ultra-Violet Production, Anh; Bio-Rad, Mỹ). • Chương trình tin sinh học: NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN 1. Chọn các enzym hạn chế 1. Chọn các enzym hạn chế
Đoạn gen N virút sởi có kích thước khoảng 550-563 bp do vậy cần phải chọn các enzym hạn chế có khả năng cắt được 2-3 lần để tạo ra các hình có từ 3-4 băng vạch. Sử dụng phần mềm NEBcutter để chọn enzym.
Quy trình thực hiện theo các bước sau: 1.1. Vào phần mềm NEBcutter:
- Sao chép và nhập tên đoạn trình tự ADN cần thiết cho chọn lựa enzym hạn chế (Hình 4).
11
của các enzym hạn chế trên đoạn ADN 572 bp virút sởi(Hình 5).
Hình 5. Vị trí cắt của các enzym hạn chế trên đoạn ADN 572 bp virút sởi
1.2.Chọn lựa enzym cắt hạn chế phù hợp:
- Ấn <Custom digest>, bảng danh mục enzym hạn chế sẽ được hiển thị. Trên bảng chỉ rõ danh mục các enzym phù hợp, vị trí cắt đặc hiệu, số lần cắt và điều kiện hoạt động tối ưu tương ứng với từng enzym. Ví dụ: Danh mục các enzym cắt hạn chế phù hợp với trình tự đoạn ADN 572 bp virút sởi (Hình 6).
Hình 6. Vị trí cắt đặc hiệu các enzym hạn chế trên trình tựđoạn ADN virút sởi
- Dựa trên danh mục các enzym đã chọn lựa enzym có vị trí và số lần cắt tối ưu. Ấn
<Digest>, cửa sổCustom Digest hiển thị vị trí cắt của mỗi enzym trên trình tựđoạn ADN cần phân tích. Ví dụ: Trình tựđoạn ADN 572 bp virút sởi được cắt bởi HaeIII (Hình 7).
12
Hình 7. Trình tựđoạn ADN 572 bp virút sởi được cắt bởi HaeIII
1.3. Xác định hình vạch ADN sau khi cắt với enzym hạn chế: Ấn <View gel>, chương trình sẽ hiển thị hình ảnh các vạch điện di, vị trí cắt và kích thước của các đoạn ADN cắt bởi enzym hạn chế. Ví dụ: Hình ảnh các băng, vị trí cắt và kích thước của các đoạn ADN 572 bp virút sởi được cắt với HaeIII (Hình 8).
Hình 8. Vị trí cắt và kích thước của các đoạn ADN virút sởi được cắt với HaeIII