Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Phân tích genotyp chủng virút sởi và Rubella bằng phần mềm Tin sinh học BioNumerics
sinh học BioNumerics
2.2.2.1. Phân tích genotyp chủng virút bằng phần mềm “BioNumerics sequence”
+Xử lý kết quả giải trình tự
Quy trình ứng dụng phần mềm “BioNumerics sequence” khởi đầu bằng việc nhập dữ liệu trình tự các mẫu ADN cần phân tích vào thư mục chủ (home directory). Trình tự nucleotit thô ban đầu là đồ thị các sóng sắc ký với 4 mầu tương ứng với từng ddNTP (A,C,T.G) thu được từ kết quả giải trình tự. Khi đồ thị sắc ký được nạp vào máy, trình tự cặp mồi xuôi và ngược hiển thị trên màn hình. Chiều của các mồi xuôi và ngược được cân chỉnh cho phù hợp. Điều cần thiết quyết định cho việc xác định đúng trình tự đoạn ADN là việc chỉnh sửa bằng tay những đỉnh sóng lỗi hoặc chồng lên nhau. Công đoạn này cần sự phối hợp giữa người làm Tin học và người làm thực nghiệm. Chương trình sẽ tự động chuyển các ký hiệu dạng đỉnh sóng sang trình tự
nucleotit tương ứng. Trình tự các nucleotit virút sởi và Rubella chỉnh sửa hoàn chỉnh
được tựđộng nạp vào cơ sở dữ liệu của thư mục chủ.
+Nhập dữ liệu trình tự nucleotit
Dữ liệu cho việc so sánh sự tương đồng giữa các genotyp gồm các trình tự ADN mẫu virút xét nghiệm và trình tự ADN chuẩn. Các trình tự nucleotit chuẩn chọn lựa từ
Ngân hàng gen NCBI được nhập vào thư mục chủ dưới định dạng GenBank hoặc FASTA. Các bước nhập dữ liệu thực hiện theo quy trình hướng dẫn do Hãng sản xuất cung cấp với sự hỗ trợ của các công cụ phần mềm. Kết thúc quy trình, toàn bộ các trình tự ADN genom chủng virút sởi và Rubella cần phân tích và trình tự chuẩn được nạp tự động vào cơ sở dữ liệu của thư mục chủ.
2.2.2.2. Phân tích genotyp chủng virút bằng phần mềm “BioNumerics fingerprint”
Điện di là một kỹ thuật quan trọng trong việc nghiên cứu các mối quan hệ trong sinh học. Phần mềm “BioNumerics fingerprint” được sử dụng như một công cụ toàn
diện cho việc phân tích kết quảđiện di trên gel.Nó cho phép tựđộng định dạng tập tin (file) đồ họa và định lượng quang học từ các tập tin hình ảnh bitmap. Dữ liệu Fingerprint cho phân tích chủng virút sởi và Rubella là bản điện di trên gel agarose.
Hình ảnh điện di đồ trên gel agarose định dạng đuôi TIFF được nhập vào thư
mục chủ của phần mềm “BioNumerics fingerprint”. Ảnh gốc bitmap hai chiều hiển thị ở dạng nền đen băng trắng sẽđược đảo chiều thành nền trắng băng đen. Trên màn hình xác định trục và đường viền để điều chỉnh các dải băng dựa trên băng chuẩn. Sử dụng các công cụ của “BioNumericsfingerprint” để tìm kiếm, đánh dấu những băng chưa rõ ràng. Có thể nâng cao chất lượng hình ảnh bằng cách lược bớt các băng nhiễu, điều chỉnh phần ảnh nền, loại bỏ những chấm bẩn trên ảnh và làm mịn đường cong. Phần mềm tựđộng phiên dịch hình ảnh các băng ADN thành các đường cong densitometric và định lượng kích thước các băng. Dữ liệu Fingerprint sau xử lí đuợc lưu vào cơ sở dữ
liệu thư mục chủ của phần mềm BioNumerics.
2.2.2.3. Dựng cây phả hệ phát sinh loài bằng phần mềm “BioNumerics Tree and
Netword Inference”
Cây phả hệ phát sinh loài và phân loại genotyp chủng virút sởi và Rubella được thiết kế bằng phần mềm “BioNumerics Tree and Netword Inference”. Phần mềm này có chức năng phân tích các cơ sở dữ liệu được chọn lựa. Các dữ liệu ở dạng trình tự
nucleotit hoặc Fingerprint thu được từ thực nghiệm và từ cơ sở dữ liệu đăng ký trên Ngân hàng gen NCBI được sử dụng làm cơ sở dữ liệu cho phân tích, so sánh cặp nhóm và dựng cây phả hệ phát sinh loài. Trung tâm của chức năng phân tích là cửa sổ so sánh “Comparison window” trong phần mềm “BioNumerics Tree and Netword Inference”.
+ Dựng cây phả hệ từ dữ liệu trình tự nucleotit
Chọn lựa các dữ liệu trình tự nucleotit virút sởi hoặc Rubella xét nghiệm và trình tự chuẩn đã được nạp sẵn trong thư mục chủ. Việc phân tích genotyp các chủng virút được tiến hành trong cửa sổ so sánh “Comparison window”. Cây phả hệ được dựng bắt đầu từ việc sắp xếp trình tự bằng cặp nhóm. Sử dụng các thuật toán để thực hiện quá trình sắp xếp các nucleotit. Toàn bộ trình tự ADN virút sởi/Rubella cần phân tích được so sánh, gióng cột thẳng hàng với các trình tự chuẩn. Tỉ lệ tương đồng giữa các trình tựđược chương trình phần mềm tính toán. Cây phả hệđược dựng tựđộng dựa
trên việc sắp xếp các nhánh theo tỉ lệđồng thuận giữa các trình tự cặp nhóm. Mỗi giao
điểm trong cây phả hệđại diện cho trình tự tương ứng của nhóm đó. Giao điểm gốc đại diện cho trình tự tương ứng của toàn bộ cây phả hệ. Chỉnh sửa hoàn chỉnh cây phả hệ
bằng các công cụ như hoán đổi vị trí nhánh, phóng to, thu nhỏ hình ảnh. Thêm các ký hiệu hoặc tô màu cho các nhánh của cây phả hệđể tách biệt các nhóm.
+ Dựng cây phả hệ từ dữ liệu Fingerprint
Chọn các dữ liệu Fingerprint của ADN virút sởi đã nạp sẵn trong thư mục chủ. Sử dụng công cụ “Comparison” của “BioNumerics Tree and Netword Inference” cho việc phân tích genotyp các chủng virút sởi và Rubella. Cây phả hệđược dựng dựa trên tỉ lệ tương đồng giữa kích thước các băng ADN virút bằng RFLP.
(Ghi chú: Quy trình công nghệ chi tiết của phương pháp nghiên cứu được trình bày trong phần Phụ lục I - Sản phẩm Khoa học & Công nghệ)