Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2.2. Giải trình tự nucleotit đoạn gen glycoprotein E1 virút Rubella
3.2.2.1. Tách chiết ARN virút Rubella
Chủng virút Rubella từ mẫu bệnh phẩm dịch họng hầu được gây nhiễm và tăng sinh trên nuôi cấy tế bào thường trực Vero SLAM. Sự nhân lên của virút trên tế bào
được quan sát và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học và hiển vi điện tử. Điểm đặc biệt là virút Rubella không gây hủy hoại điển hình trên tế bào như virút sởi, do vậy việc quan sát các đám tế bào hoại tử thường không dễ dàng. Việc chọn lựa chủng dương tính cần có thêm kết quả chẩn đoán huyết thanh học [8]. Các nuôi cấy tế bào dương tính sau 7 ngày gây nhiễm được chọn cho việc tách chiết ARN virút. Toàn bộ
ARN virút Rubella được tinh sạch từ 280 µl dịch tế bào gây nhiễm. Mẫu ARN tinh sạch được giữ nguyên trên cột và bảo quản ở -20°C. Công đoạn này có cải biên so với thường quy của bộ sinh phẩm. Sự cải biên này được xây dựng dựa trên yêu cầu thực tế
của việc bảo quản và vận chuyển chủng virút nguy hiểm. Các mẫu ARN được giữ trên cột không bị biến tính và đảm bảo an toàn sinh học cao.
3.2.2.2. Kết quả RT-PCR khuếch đại ADN gen E1 virút Rubella
RT-PCR là một trong các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng thường nhật trong chẩn đoán bệnh Rubella.Các nghiên cứu đều tập trung xác định đoạn ADN
đặc hiệu virút Rubella trên trình tự glycoprotein E1 từ nucleotit 8251 đến 9693. Trong nghiên cứu này, 10 mẫu ARN virút Rubella tinh sạch từ các nuôi cấy tế bào Vero Slam
gây nhiễm chủng virút được chọn lựa cho phản ứng RT-PCR. Đoạn ADN đặc hiệu glycoprotein E1 virút Rubella được tổng hợp từ ARN bởi enzym phiên mã ngược Superscript II RT và các thành phần của bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR.
1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 3.2.2.2a.Ảnh điện di sản phẩm ADN genom virút Rubella sau RT-PCR
1,2,3,4,5. Mẫu ADN Rubella phân tích 7. Chuẩn âm tính