2
GIỚI THIỆU
Phương pháp PCR-RFLP được phát triển dựa trên sự kết hợp nguyên lý của hai kỹ thuật PCR và RFLP. Phương pháp PCR-RFLP được ứng dụng trong sàng lọc và phân loại sớm bệnh sởi, Rubella và các bệnh sốt phát ban khác.
Phương pháp PCR-RFLP được thực hiện với các công đoạn sau:
• RT-PCR: Khuếch đại đoạn ADN khoảng 590 nucleotit đầu tận cùng –COOH của gen Nucleoprotein N virút sởi và đoạn ADN khoảng 400 nucleotit gen glycoprotein E1 virút Rubella.
•Nested-PCR: Với các chủng virút không xác định được băng ADN sau RT-PCR, cần tiến hành tiếp phản ứng Nested PCR. Phản ứng Nested PCR làm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng PCR thứ nhất bằng cách nhân lên đoạn ADN bên trong vùng khuếch đại. Với các cặp mồi chọn lựa, đoạn ADN gen N virút sởi có kích thước khoảng 492-576 bp bên trong vùng khuếch đại đươc nhân lên.
• RFLP là tên gọi tắt của phương pháp Đa hình chiều dài các đoạn cắt enzym hạn chế (Restriction enzym). Phương pháp RFLP cho khả năng phát hiện các thay đổi cấu trúc ADN qua các hình vạch trên bản gel điện di. Enzym cắt hạn chế là những endonucleaza do vi khuẩn sinh ra và có khả năng nhận biết những vị trí cắt hạn chế để cắt chuỗi ADN dài thành những phân đoạn có chiều dài khác nhau.
Quy trình kỹ thuật RFLP được ứng dụng trong phân tích đoạn ADN 550-563 bp gen N virút sởi. Dựa trên chương trình tin học NEBcutter (New England Biolabs, Mỹ) các enzym HaeIII,
MboI và ScrFI đã được chọn lựa để phân tích genotyp chủng virút sởi. Dựa trên sự biến đổi của các ví trí cắt hạn chế trên trình tự ADN gen N tính đa dạng của genotyp virút sởi được phân tích.
3
ARN virút được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm: dịch họng hầu, nước tiểu, CSF… Các mẫu được được giữở -700C.
Vật liệu, sinh phẩm, hoá chất
• Mẫu ARN virút sởi
• Mồi đặc hiệu cho RT-PCR nhân đoạn ADN 587 bp gen N virút sởi (Invitrogen, Mỹ) • Mồi đặc hiệu cho Nested- PCR nhân đoạn 576 bp gen N virút sởi.(Invitrogen, Mỹ) • Kit QIAamp Viral RNA Isolation (QIAgen, Mỹ).
• Kit Superscript One-step RT-PCR / platinium Taq polymerase (Invitrogen.,Mỹ) • Kit PCR Platinium Taq DNA polymerase (Invitrogen, Mỹ)
• Hoá chất sinh phẩm: Thang ADN chuẩn 100 bp, Agarose, Tris base, EDTA, Edithium Bromid … (Bio-Rad, Mỹ)
• Máy PCR (Eppendorf, Đức; Bio-Rad, Mỹ)
• Máy ly tâm, micro centrifuge tube (Eppendorf, Đức). • Máy điện di (Bio-Rad, Mỹ).
• Máy chụp ảnh gel doc (Hãng Ultra-Violet Production, Anh; Bio-Rad, Mỹ).
Trình tự cặp mồi cho phản ứng
RT-PCR
- Mồi xuôi (n1): 5' GCT ATG CCA TGG GAG TAG GA 3' ( n552-1) - Mồi ngược (n2R): 5' GGC CTC TCG CAC CTA GTC TA 3' ( n552-2) Nested-PCR
- Mồi xuôi (n3):5' CCA TGG GAG TAG GAG TGG 3' ( n552-3) - Mồi ngược (n4R):5' CTC TCG CAC CTA GTC TAG 3' ( 552-4)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN